瞬时受体电位通道TRPC（Transient receptor potential canonical）作为一种Ca²⁺非选择性的阳离子通道，在兴奋性细胞和非兴奋性细胞中广泛表达。TRPC在人体内表达6种，TRPC1，C3，C4，C5，C6，C7，TRPC2是一种假基因而不表达。这6种成员按照序列的同源性可划分为2个亚群：TRPC1，C4，C5为一个亚群，TRPC3，C6，C7为另一个亚群。功能性的TRPC通道有赖于4个单分子的TRPC亚基彼此聚合形成四聚体，这一点是由它与电压门控钾离子通道结构的相似性推导而来，并且在TRPC3的3D模型中得到证实。TRPC的这种聚合可发生在同种分子之间，形成同源聚合体，也可发生在不同成员之间，形成异源聚合体。异源聚合体又存在几种情况：（1）最早的研究证实，TRPC的聚合可发生在同一亚群内部，如TRPC1，C4，C5之间，或者TRPC3，C6，C7之间，两个亚群之间则不能交叉聚合；（2）此后，进一步的研究证实，TRPC1可作为一种连接分子，将两个不同亚群分子之间联系起来；（3）再后来，更多的研究证实，任意两种TRPC之间，无论同一亚群，或者不同亚群，均可相互结合。目前，普遍认为，所有的TRPCs均可形成同源聚合体，任意两种TRPCs之间均可形成异源聚合体。TRPC间的聚合具体发生在哪个片段，这方面的研究尚少，仅有少量的研究证实，TRPC4分子内部的自身结合是通过其N-末端的相互作用，对于其它分子的结合，目前尚无更多的研究验证其结合部位。另外，此前针对蛋白质分子之间结合的研究所使用的方法，一般都是免疫共沉淀CoIP, GST-pull down等，这些方法的缺陷在于，不能反映活细胞中蛋白表达及结合情况。另一方面，TRPC通道的功能研究一直是近年来的热点，已有大量研究表明，TRPC作为一种Ca²⁺通道，它参与了受体介导的Ca²⁺内流（ROCE，receptor-operatedcalcium entry），以及该库操控的Ca²⁺内流（SOCE, store-operated calcium entry）两种机制。目前已知的TRPC3，C6，C7具有钆抵抗的特点，可产生钆抵抗的受体介导的Ca²⁺内流现象（Gd3+-resistant-ROCE），各种TRPCs均可产生Tg诱导的钙库操控Ca²⁺内流现象（Tg-induced-SOCE）。但与其功能相关的具体结构域，即TRPC分子上到底哪段区域对其功能性通道通透Ca²⁺发挥关键作用，这方面的研究尚不多。本课题研究的目的在于，使用一种新方法双分子荧光互补实验BiFC，在活细胞中观察蛋白质分子之间的相互结合，进一步证实TRPC分子可以形成同源或异源结合。该方法通过在HEK293细胞中外源共表达两种完整TRPC-VN155/VC155，或者共表达一种完整TRPC-VN155/VC155和一种去除氨基端的TRPCΔN-VC155/VN155，通过激光共聚焦显微镜观察活细胞中荧光信号强度，对比二者之间的差异，从而验证N端对于TRPC分子间相互结合的作用。CoIP和Western Blot作为一种补充手段，进一步验证N端在介导TRPC分子之间相互结合的作用。此外，采用Ca²⁺影像(Ca²⁺image)技术，测定TRPC3，C6，C7全长或去N端的突变体在ROCE现象中对Gd3+的反应，以及TRPC1，C4，C5全长或去N端的突变体对Tg-induced SOCE的反应，以证实TRPC的N端在介导Ca²⁺内流中的重要性。BiFC结果显示，共转两种完整TRPC-VN155/VC155所产生的荧光信号，比共转一种完整TRPC-VN155/VC155和一种去N端TRPCΔN-VC155/VN155所产生的信号明显较强。使用CoIP和Western Blot，结果显示，myc-标记的TRPC-VN155可被HA-标记的TRPC-VC155共沉淀下来，在使用anti-myc抗体后出现阳性结果。而myc-标记的TRPC-VN155不能被HA-标记的TRPCΔN-VC155共沉淀下来，在使用anti-myc抗体后则出现阴性结果。该现象不仅在表达一种同源TRPC系统中出现，也在表达两种异源TRPC系统中出现。Ca²⁺image结果显示，表达完整TRPC3，C6，C7-VN155/VC155的细胞均表现出Gd3+-resistant-ROCE，而表达去N端的TRPC3，C6，C7ΔN-VN155/VC155的细胞该现象消失。表达完整TRPC1，C4，C5-VC155均表现出Tg-induced SOCE现象，而表达去N端的TRPC1，C4，C5ΔN-VC155对Tg的诱导不产生反应。综上所述，本实验进一步证明，任意一种TRPC均可形成同源聚合，任意两种不同TRPC之间均能形成异源聚合。无论同源或异源聚合，都需要N端存在。而TRPC通道正常发挥Ca2+通透的功能也需要N端的存在。可见，TRPC的N端在介导TRPC分子间形成同源或异源聚合体，以及介导Ca2+内流方面，均发挥关键性作用。