1研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)被认为是有多种免疫反应参与的慢性炎症性疾病,主要以动脉壁的脂质浸润、积累以及各种炎症免疫细胞的参与为特点。异常的炎症免疫在动脉粥样硬化的发生发展中发挥关键作用,但其触发机制迄今仍未完全阐明。T细胞是获得性免疫和炎症反应的关键调控者,与动脉粥样硬化的发生和进展密切相关。在斑块形成之前的脂质条纹阶段,淋巴T细胞已存在于病灶区。但是,目前对于T细胞在AS发生发展中的具体作用仍然存在一些争论。人和小鼠的动脉斑块中的T细胞主要是表达αβT细胞受体(T cell receptor,TCR)的CD4辅助性T细胞,双敲(Apoe-/-or Ldlr-/-)的老鼠免疫缺陷可以减轻AS的发生发展,给予CD4T细胞能逆转免疫缺陷的抗AS作用。但是,有研究在CD4T细胞免疫缺陷的Apoe-/-小鼠中得出了不一致的结论,发现给予高脂饮食后的免疫缺陷和免疫状态良好的小鼠AS的发生发展并无明显区别。不同T淋巴细胞亚群在AS发生发展中作用的复杂性和多样性可能是导致这些争论的原因之一。这些争论提示T细胞在AS发生发展中的作用远比人们想象的复杂,而T细胞亚群/克隆组成的多样性和可变性是导致这种复杂性的主要原因之一。因此,深入的揭示AS患者T细胞的克隆构成和变化特征可能为解答上述复杂的问题提供证据。某一特定范围的所有特异性不同的T细胞克隆的综合,就是该范围T细胞的免疫组库,它的多样性和组成特征直接反应了免疫应答的状态。因此,T细胞免疫组库在很多疾病中都存在显著异常。基于高通量测序的免疫组库测序技术已开始应用于免疫组库研究领域,它以T/B淋巴细胞为研究目标,对于多重或cDNA 末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)PCR 技术获得的B细胞受体(B cell receptor,BCR)或T细胞受体(TCR)不同区域进行高通量测序,能够以单碱基分辨率确定数百万种不同T或B细胞克隆。这一技术使全面准确的评估免疫系统的多样性成为可能。本研究有助于深入理解T细胞在动脉粥样硬化性心血管疾病(Atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)发生发展中的作用,揭示AS病变中炎症免疫异常的机制。2目的(1)利用免疫组库测序技术,分析AS患者外周血和斑块内T淋巴细胞免疫组库的构成和分子特征,包括克隆频率、互补决定区3长度分布(Complement determining region 3,CDR3)、CDR3 多态性、V/D/J 基因利用率等;(2)揭示AS患者与正常人相比,外周血和斑块内细胞克隆的分子类型和变化。3方法3.1外周血样本和组织样本的收取收取55例符合急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome,ACS)诊断的病人的外周血,每例5ml,并收取56例健康人的外周血作为对照。用Ficoll密度梯度离心方法分离外周血的单个核细胞。组织样品来自尸检标本和有AS斑块的标本。3.2基因组DNA的提取利用离心吸附DNA技术提取纯化外周单个核细胞和组织样本的基因组DNA,从相应分组中的每一个样本中,收取相同量的gDNA混在一起,组成ACS外周血、正常外周血、动脉斑块的样本池。3.3多重聚合酶链式反应通过多重聚合酶链式反应,使用用于TCR-[βCDR3V和J区的特异设计的引物组,从基因组DNA扩增重排的TCR-βCDR3区。3.4高通量测序纯化多重PCR的产物,对DNA片段进行文库构建。随后,通过Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus实时PCR系统评估文库质量(插入片段长度和文库浓度)。桥式PCR扩增后,在Hiseq2000测序平台上进行双端101-bp测序。3.5生物信息学分析经严格标准过滤原始测序数据。过滤后,使用miXCR进行序列比对,调整测序和PCR引入的数据错误,并鉴定不同的CDR3序列及提供其表达情况的信息。该软件还提供了 CDR3区域的氨基酸序列,以及相应读数、插入缺失和V-D-J基因的数目和频率。其他分析,如频率间隔分布、累积频率分布和VDJ利用率,使用自制脚本和Microsoft Excel软件进行分析。多样性指数,包括香农指数,辛普森指数和伯杰-帕克指数,使用BPMSG网站的多样性计算器得出。3.6实时定量多聚酶链式反应(RT-PCR)通过Nanodrop 2000对每组纯化的gDNA进行定量。然后,使用SYBR Green Master Mix在Bio-Rad CFX96上进行实时定量多聚酶链式反应。β-肌动蛋白用作内部对照。3.7数据分析数据表示为平均值±SEM,并使用双尾t检验或单因素方差分析进行比较。P<0.05被认为具有统计学意义。使用GraphPad Prism软件和Excel进行统计分析。4实验结果4.1 T细胞克隆种类和频率分布在AS病变中显著异常在健康受试者的外周血中,氨基酸和核苷酸水平的T细胞的特异克隆类型与ACS患者的外周血和AS斑块相比显著增高。此外,AS斑块中前1000位T细胞克隆的频率显著高于正常受试者和ACS患者的外周血中的频率。AS斑块中的T细胞克隆数显著高于正常受试者和ACS患者的外周血(0.1-0.4%)。而且,较少的T细胞克隆在AS斑块中具有较高的累积频率。4.2 T细胞克隆长度分布特征在氨基酸和核苷酸水平,三组的共同克隆的CDR3长度显示正常分布。11-16个氨基酸长度的共同T细胞克隆的频率在AS斑块中显著高于正常受试者和ACS患者的外周血中的频率。此外,AS斑块中具有某些核苷酸长度的共同T细胞克隆的频率显著高于其他组中的频率。4.3共同克隆分布特征分析正常男性和女性外周血中共同T细胞克隆的频率和数量相似,并且显著高于ACS患者相应性别的外周血中的频率和数量。ACS男性患者外周血中共同T细胞克隆的频率分布和数量与ACS女性患者的频率分布和数量显著不同。此外,AS男性患者的斑块中的共同T细胞克隆显著升高。4.4 T细胞克隆开放读码框分析AS斑块中的开放读码框内T细胞克隆的比例显著高于正常受试者和ACS患者外周血中的比例,而AS斑块中的读码框外的T细胞克隆的比例低于其他组。4.5 T细胞克隆插入和氨基酸利用率的特点分析在所有组中T细胞克隆的TCR CDR3区域中的核苷酸插入无显著差异,所有组中T细胞的TCR CDR3插入的长度大多<20个核苷酸。在所有三组的个体中TCR蛋白质中20种常见氨基酸的利用率没有显著差异。4.6 T细胞克隆多态性分析AS斑块中T细胞克隆的多样性指数包括香农系数、辛普森系数,伯杰-帕克指数显著降低,表明AS斑块的T细胞克隆的多样性是减少的。4.7 T细胞克隆VDJ基因利用率分析在斑块中T细胞的VJ基因的利用率显著减少。AS斑块中的高频T细胞克隆例如V20-1-J2-7和V20-1-J2-5与其他两组相比显著升高。AS斑块中一些V基因(例如 TRBV4-1、TRBV5-4、TRBV12-4)和 J 基因(例如 TRBJ2-5、TRBJ2-1、TRBJ1-6)的利用率显著不同于其他两组。4.8 AS斑块中显著扩增的T细胞克隆的PCR验证实时PCR验证结果显示,ACS患者外周血中V29-1 J2-1、V20-1 J1-6、V6-3 J2-7和V11-2 J2-2克隆的含量或频率显著高于正常受试者。5结论(1)与正常受试者和ACS患者外周血中的T细胞克隆相比,AS患者斑块中的T细胞克隆类型显著降低;(2)三组中不同长度CDR3区域的TCR共同克隆的频率显著不同。与其他两组相比,AS斑块组的共同克隆(特别是高频共同克隆)升高;(3)AS斑块的T细胞克隆多态性显著降低,V和(或)J基因的利用率显著降低。1研究背景动脉粥样硬化(Atheroclerosis,AS)是急性心肌梗死等严重心脑血管事件的主要病理基础。主要特征为全身大中动脉的进行性脂质沉积、炎性细胞浸润和纤维组织增生。AS发病机制复杂,迄今尚未完全阐明,但大量研究表明氧化低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)是触发血管炎症反应,造成血管内皮损伤,启动AS发生的主要物质之一。Ox-LDL造成内皮损伤的机制涉及免疫细胞和内皮细胞等多种细胞内和细胞间的复杂信号传递,主要包括:1)激活T细胞等炎症免疫细胞,通过细胞毒性作用或分泌细胞因子间接杀伤内皮细胞;2)被内皮细胞摄取,直接抑制其增殖和迁移,诱导凋亡,造成血管内皮损伤;3)诱导内皮细胞分泌炎症因子和粘附分子等,通过吸引炎症免疫细胞直接作用造成内皮损伤。目前人们已经在单一细胞中充分研究了 ox-LDL的作用,但它对不同细胞间信号传递的影响和机制的研究还不充分。明确细胞间信号传递的分子,揭示ox-LDL对免疫细胞和其它细胞间通讯的作用和机制,将有助于全面理解ox-LDL和炎症免疫在AS发生发展中的作用,为寻找有效的干预措施提供理论依据。各种激素、细胞因子和血管活性物质都是细胞间通信的重要信使分子,它们或者被直接分泌到细胞外,或者在微粒体和外泌体等细胞外膜结构中,传递信号、调控相应靶细胞的功能。研究表明除了经典的蛋白质分子,在细胞外环境中也存在稳定的miRNA分子(在血浆或血清中的即为循环miRNA),这些细胞外miRNA是一类新的具有细胞间通讯功能的信号分子,能以自分泌/旁分泌的方式发挥调控作用,也能通过循环到达远端靶细胞,以内分泌的方式调控靶细胞功能,是一种普遍而重要的细胞间通讯方式。有研究认为循环miRNA主要是包装到外泌体和微粒体等胞外膜结构中运输,但也有研究则认为循环miRNA主要以核酸蛋白复合物的形式在循环中运输;最近有研究表明循环miRNA选择何种形式运输可能与miRNA的种类、细胞来源和疾病病程等有关,但关于循环miRNA如何识别并结合靶细胞的细节,以及在疾病中这一过程有何异常及其意义目前仍不清楚。这些争论和问题说明人们对循环miRNA这种新的细胞间信号分子的功能和机制了解还很少,深入研究循环miRNA在AS发生发展中的作用及其机制,对于将循环miRNA作为AS的生物标志物和治疗手段用于临床有重要意义。2目的(1)寻找细胞间信号传递分子,高通量测序方法阐述免疫CD4+T细胞分泌的外泌体中RNA种类构成;(2)研究外泌体运输的let-7e在调节内皮功能方面的角色,揭示ox-LDL在免疫细胞和内皮细胞通讯中发挥的作用和机制。3方法3.1 CD4+T细胞的提取及内皮细胞的培养收取ACS患者外周血,经Ficoll密度梯度离心方法分离PBMCs,磁珠抗体分离高纯度的CD4+T细胞。HUVECs细胞在ECM培养基,5%CO2,37℃的培养箱中培养,购买自ATCC。3.2 CD4+T细胞分泌的外泌体的提取Ox-LDL刺激提取的CD4+T细胞48h后,收取培养基,经超速离心得到外泌体沉淀。3.3实时定量聚合酶链反应通过RNA提取,逆转录和RT-PCR的方法对样本let-7e表达水平进行检测,U6作为对照。3.4免疫印迹(western blot)检测经过提取总蛋白、凝胶电泳、转膜、标记一抗和二抗、ECL曝光等步骤观察目的蛋白的表达。3.5高通量测序分析及数据分析提取外泌体total RNA构建RNA文库,对文库质量进行评估后,桥式PCR扩增,在Hiseq2000测序平台上进行配对末端151-bp测序。经过严格标准过滤原始数据,经过组装后,与RNA数据库比对,鉴定不同的miRNAs和mRNAs及提供其表达情况的信息。3.6免疫荧光及凋亡检测PKH-26标记外泌体后与HUVECs共同培养,24h后观察HUVECs的摄取外泌体和凋亡情况。4结果4.1 CD4+T细胞的分选纯度磁珠分选CD4+T后,流式细胞仪检测CD4+T细胞的纯度可达98%,高纯度的细胞利于下一步实验的顺利开展。4.2外泌体的分泌及鉴定Ox-LDL刺激CD4+T细胞后,可促进其分泌外泌体进入培养基,收取培养基中的外泌体,进行电镜检测,发现颗粒处于50-100nm之间,western blot发现其有CD63的表达。4.3外泌体RNA测序数据分析测序结果发现外泌体不仅含有众多的miRNA,还包含着许多mRNAs和IncRNAs,对mRNA基因功能富集分析发现,外泌体可能参与了众多生物学过程,包括细胞的凋亡、增殖、炎症免疫等反应。4.4 CD4+T以外泌体的形式分泌let-7eRNA测序结果发现CD4+T分泌的外泌体含有众多miRNAs,其中包含了丰度值较高的let-7e。而且RT-PCR发现与正常人的CD4+T细胞相比,AS病人的CD4+Tlet-7e表达量明显升高。同时我们发现,ox-LDL刺激CD4+T细胞后,其分泌的外泌体中的let-7e表达量明显升高,说明ox-LDL能促使CD4+T细胞以外泌体形式分泌let-7e。4.5 CD4+T分泌的外泌体可以被内皮摄取影响内皮功能提取CD4+T细胞分泌的外泌体,与HUVECs共培养发现CD4+T分泌的外泌体可被内皮细胞所摄取,且经过ox-LDL处理的CD4+T分泌的外泌体能够明显促进内皮细胞的凋亡。5结论(1)CD4+T细胞可分泌外泌体进入培养基或者血浆,它们不仅含有大量的miRNAs(包括 let-7e),还包含众多 mRNAs 和 IncRNAs。(2)ox-LDL处理CD4+T细胞后,其分泌的外泌体中包含的miRNAlet-7e表达升高。(3)CD4+T细胞释放的外泌体转运let-7e进入HUVECs,并影响了内皮细胞的凋亡。1研究背景血管内皮细胞(Endothelial cells,ECs)在免疫和炎症反应中发挥至关重要的作用。在炎症刺激激活的ECs中,通过抑制抗炎细胞因子可使许多粘附分子和促炎细胞因子上调(例如ICAM1,SELE和IL-6)。过度的炎症刺激引起的内皮功能障碍是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)和许多其他心脑血管疾病发展中最重要的起始事件之一。许多细胞和分子参与ECs的炎症反应,但是其调节机制非常复杂,迄今尚未完全阐明。有研究表明miRNA可作为ECs中炎症的关键调节剂。例如,miR-146a和miR-10a可通过靶向ECs中NF-kB途径的多种组分(TRAF6/IRAK4)抑制炎症;miR-92a通过靶向抑制NF-kB表达的KLF2/KLF4促进ECs中的炎症。另外,miRNA也直接靶向各种粘附分子,在活化的ECs中发挥抗炎作用,例如miR-31靶向SELE和miR-17-3p靶向ICAM1。此外,miRNA参与内皮炎症在众多疾病如动脉粥样硬化和糖尿病中发挥关键作用。因此,需要进一步的研究揭示更多的miRNA及其参与内皮细胞炎症反应的作用机制。let-7家族可以通过靶向促炎因子(例如let-7d靶向IL-13;let-7a靶向IL-6)发挥抗炎作用,也可以通过靶向抗炎因子例如IL-10而充当促炎因子。另外,let-7家族与内皮功能密切相关,包括凋亡、血管生成和内皮-间质转化。Let-7e是let-7家族的一员,具有调节内皮功能和炎症的重要功能。此外,有研究表明let-7e在包括冠心病在内的许多心血管疾病中表达显著增加。因此,我们推测let-7e可能通过直接或间接靶向某些炎症基因在调节内皮细胞的炎症反应中起关键作用。然而,到目前为止还没有证实这种假设的研究。2目的(1)系统阐述let-7e参与调控内皮细胞的各种生物学过程;(2)揭示let-7e调控内皮功能和炎症反应的机制。3方法3.1细胞培养及处理HUVECs细胞在ECM培养基,5%CO2,37℃的培养箱中培养。内皮细胞经50μg/ml ox-LDL处理,并在12h、24h、48h后收取细胞。3.2质粒构建及转染IkBβ和野生/突变体Inc-MKI67IP-3的pCMV6载体和siRNA购自GenePharma 和 Origene。使用 lipofectamine RNAIMAX 或 3000 试剂将 let-7e的模拟物/抑制剂/阴性对照(Negative control,NC),siRNA或不同载体分别转染到HUVEC中。3.3 RNA提取转染了 let-7e模拟物或抑制剂和相应的NC的HUVECs提取total RNA,并通过Nanodrop 2000分光光度计和Qubit 3.0荧光计定量。它们的质量也使用Agilent 2100生物分析仪进行评估.3.4芯片分析总RNA用cy3标记并与Agilent人类LncRNA 4×180K微阵列杂交。将mRNAs和IncRNAs的表达数据过滤并标准化,然后使用GeneSpring GX11.5确定 let-7e 调节的 IncRNAs 和 mRNAs。3.5生物信息学分析3.5.1功能富集分析使用用于注释,可视化和集成发现的数据库(DAVID)v6.7进行功能富集分析。3.5.2 let-7e潜在靶基因预测Let-7e 靶基因由 Targetscan,Micro T-CDS 和 miRanda 进行预测。在 let-7e模拟物组和let-7e抑制剂组中相反表达的转录本与上述工具预测的靶基因取交集,被认为是let-7e在HUVECs中的潜在靶基因。3.5.3构建共表达网络基于let-7e的预测靶点,使用CoExpress v1.5构建潜在地结合let-7e的IncRNAs和可能靶向let-7e的mRNAs的共表达/相关网络(Pearson相关系数>0.99,P<0.05)。然后,使用Cytoscape软件分析其拓扑结构和核心子网。3.6实时定量聚合酶链反应通过RNA提取,逆转录和RT-PCR的方法对各样本let-7e,pri-let-7e和mRNA表达水平进行检测,U6和β-actin作为对照。3.7酶联免疫吸附实验EILSA收集的培养基通过ELISA试剂盒检测ICAM1,VCAM1,SELE,SELP和IL-6的表达水平。3.8免疫印迹(western blot)检测经过提取总蛋白,胞浆蛋白和核蛋白、凝胶电泳、转膜、标记一抗和二抗、ECL曝光等步骤观察目的蛋白的表达。3.9荧光素酶报告实验将IkBβ3’-UTR或Inc-MKI67IP-3中let-7e的靶/结合序列(或其突变体)克隆到pmirGLO双荧光素酶miRNA靶表达载体中构建萤光素酶报道载体,分别用这些载体和let-7e模拟物/抑制剂或相应的NC转染HUVEC。双荧光素酶报告测定系统测定样本的萤火虫和海肾萤光素酶活性。3.10数据分析使用Benjamini-Hochberg校正来校准多个测试中的P值。使用自制脚本计算相关系数和P值。数据表示为平均值±SEM,并使用双尾t检验或单因素方差分析进行比较。P<0.05被认为具有统计学意义。R程序语言包用于所有计算。4实验结果4.1 let-7e调节的mRNAs/IncRNAs表达谱和功能富集分析芯片分析结果显示let-7e明显影响mRNAs和IncRNAs的表达,选择let-7e潜在靶向的385个mRNAs和let-7e潜在结合的102个IncRNAs分层聚类。let-7e模拟物抑制基因表达的作用非常明显,而let-7e抑制剂的作用与之相反。487转录本的基因集富集分析显示let-7e参与许多重要的生物过程和途径,例如免疫、细胞粘附、VEGF途径、NF-kB/MAPK途径。大多数途径与细胞增殖、凋亡和炎症反应密切相关。4.2 let-7e潜在调节的共表达相关网络基于上述487个转录本的表达数据构建共表达/相关网络,这个大网络的拓扑分析显示26个重要节点,包括NFKBIB(IkBβ)、MAPK1、DNMT3A和TP53BP1,它们参与炎症、增殖和凋亡的调节。选择与IkBβ显著共表达的节点构成的子网,在这些节点中,IkBβ和Inc-MKI67IP-3变化最显著。4.3 let-7e在内皮细胞中的促炎作用芯片数据表明let-7e可以上调HUVEC中许多关键的促炎细胞因子和粘附分子的表达,如 IL-1B、IL-6、ICAM1、VCAM1、SELE 和 SELP,而 let-7e 抑制剂作用相反。此外,他们大多数都受NF-kB调节。let-7e模拟物可以显著增加上述因子的分泌和mRNA表达,而let-7e抑制剂的作用不显著。4.4let-7e通过靶向IkBβ促进NF-kB发挥促炎作用let-7e模拟物在HUVEC中在mRNA和蛋白水平上显著降低IkBβ表达,但let-7e抑制剂相反作用。荧光素酶活性检测还显示let-7e模拟物显著降低转染了Luc-IkBβ-WT的HUVEC中的相对荧光素酶活性。Let-7e模拟物促进NF-kB转移到细胞核中并激活。4.5 Lnc-MKI67IP-3作为ceRNA抑制let-7e的促炎作用预测结果表明let-7e可以结合Inc-MKI67IP-3。萤光素酶报告检测显示,let-7e模拟物显著降低了用Iuc-Inc-MKI67IP-3-wt转染的HUVEC中的相对荧光素酶活性。与对照组相比,Inc-MKI67IP-3-wt载体可以减弱let-7e抑制IkBβ表达,显著增加IkBβmRNA和蛋白的表达。此外,let-7e模拟物显著下调Inc-MKI67IP-3表达,而let-7e抑制剂显著上调其表达。4.6 let-7e在ox-LDL处理的内皮细胞中和动脉斑块中上调ox-LDL处理HUVECs不同时间后,RT-PCR发现ox-LDL显著上调let-7e和pri-let-7e的表达,而IkBβ和Inc-MKI67IP-3的表达显著下调。此外,let-7e,IkBβ和Inc-MKI67IP-3在人动脉粥样硬化斑块中的表达与ox-LDL处理的HUVEC中的表达相似。5结论(1)通过抑制其靶基因IkBβ,let-7e可促进NF-kB转移到细胞核和活化,增强ECs中的炎症反应。(2)let-7e通过ceRNA交互作用网络机制调控NF-kB信号通路,发挥促炎调节因子的作用。(3)Inc-MKI67IP-3可以拮抗let-7e对IkBβ的抑制作用,而let-7e可下调Inc-MKI67IP-3,形成正反馈加重炎症。(4)let-7e,Inc-MKI67IP-3和IkBβ在oxLDL处理的HUVEC和动脉粥样硬化斑块中异常表达。