研究背景糖尿病足部溃疡是糖尿病的严重并发症之一,在糖尿病病程中大约有25%的病人会发生下肢溃疡。目前标准治疗方案主要包括清创、创面敷料覆盖保湿、创面感染控制、血管再造和减压治疗。但即使予以这些标准化治疗,糖尿病创面仍然愈合缓慢,大约7%-20%的病人最终需要截肢。现临床急需新的治疗手段加速糖尿病创面愈合,阻止足部溃疡最终导致的截肢。人羊膜来源于胎盘的最内层,主要包括单层羊膜上皮细胞层、厚基底膜层以及无血管基质层。早在20世纪初就有应用羊膜治疗创面的临床报道并取得了良好的效果。在过去的一百年中羊膜在创面愈合中的作用被许多文献所证实,主要通过加速上皮化、减轻炎症反应、抑制瘢痕形成和抗菌等作用促进创面愈合。近年来研究表明羊膜上皮细胞为多能干细胞,能向三个胚层细胞分化,且局部注射羊膜细胞浸提液及羊膜上皮细胞能加速急性创面的愈合。尽管此前众多研究表明羊膜在创面修复中的巨大潜能,但仍然存在许多缺点限制了人羊膜临床应用潜能的最大化。首先,目前的保存方法(冷冻干燥法、伽马射线灭菌法以及甘油保存等)无法完整保存羊膜细胞活性,导致羊膜上皮细胞活性完全丧失或仅保存极低活性。其次,羊膜非常薄,机械强度低,目前临床应用大张羊膜覆盖创面难以保证羊膜完全平整粘附到创面,羊膜很容易变干而与创面分离,仅能作为暂时的生物敷料短时间覆盖创面。另外,羊膜上皮细胞在慢性创面中的治疗作用及机制研究,以前未见报道。在本课题中,我们临床获取胎盘废弃新鲜羊膜并采用自制微粒皮切割机将其加工为300-600微米大小的微粒化羊膜。在应用商品化的无血清干细胞冻存液冻存微粒羊膜半年后,我们复苏羊膜并检测其形态结构、细胞活性及生物活性因子,随后移植复苏后的微粒羊膜修复糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面,评估其治疗有效性。结果发现本研究所采用的冻存方法能良好保存羊膜的天然结构、细胞活性及生物活性因子。局部应用冻存微粒羊膜能明显促进糖尿病小鼠创面愈合,且移植后微粒羊膜中的羊膜上皮细胞能保持高移植潜能,在创面存活率高。随后我们进一步探究冻存活性微粒羊膜促进糖尿病创面愈合的机制,主要通过体内及体外实验探讨冻存活性微粒羊膜对糖尿病创面炎症的调控和新生血管化的影响,以及羊膜基质能否作为真皮替代物长期存在于创面促进真皮重构。研究方法1.采用自制微粒皮切割机将人新鲜羊膜制备为300-600微米大小微粒化羊膜,随后应用无血清干细胞冻存液STEM-CELLBANKERTM冻存微粒羊膜半年,通过下面方法检测冻存效果。(1)H&E切片染色检测复苏后羊膜结构;(2)live/dead细胞活性试验检测复苏后羊膜上皮细胞活性;(3)扫描电镜观察复苏后羊膜上皮细胞膜结构;(4)收集冻存活性微粒羊膜条件培养基,采用人生长因子抗体芯片、人趋化因子抗体芯片及人炎症因子抗体芯片分别检测活性微粒羊膜条件培养基中生长因子、趋化因子及炎症因子的表达情况。2.将糖尿病小鼠分为三组:冻存活性微粒羊膜组、冻存去细胞微粒羊膜组和空白对照组。将冻存活性微粒羊膜移植于糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面并通过检测以下指标评估其修复效果。(1)定期拍照观察创面愈合大体形态并计算不同时间点创面愈合率;(2)H&E染色观察愈合创面的组织结构及羊膜在创面的降解情况;(3)H&E染色及免疫组织化学染色抗人线粒体抗体观察冻存活性微粒羊膜移植后羊膜上皮细胞转归情况,TUNEL染色检测人羊膜上皮细胞移植于创面后凋亡情况;(4)免疫组织化学染色抗F4/80抗体观察创面巨噬细胞数量,流式细胞术检测创面M1型及M2型巨噬细胞比例。ELISA检测创面促炎因子及创面愈合相关因子的表达情况;(5)流式细胞术检测冻存活性微粒羊膜移植后外周血内皮祖细胞数量,免疫组织化学染色抗CD34和CD31抗体分别检测创面造血祖细胞及新生血管数量。3.收集冻存活性微粒羊膜条件培养基,通过以下方法评估其对原代鼠骨髓来源巨噬细胞、人脐静脉内皮细胞、人原代成纤维细胞和表皮细胞功能的影响。(1)CCK-8法检测冻存活性微粒羊膜条件培养基对原代鼠骨髓来源巨噬细胞、人脐静脉内皮细胞、人原代成纤维细胞和表皮细胞增殖能力的影响;(2)Transwell小室测定冻存活性微粒羊膜条件培养基对原代鼠骨髓来源巨噬细胞、人脐静脉内皮细胞、人原代成纤维细胞和表皮细胞迁移能力的影响;(3)小管形成实验检测冻存活性微粒羊膜条件培养基对人脐静脉内皮细胞成小管能力的影响;(4)IFN-γ和TNF-α刺激原代鼠骨髓来源巨噬细胞为M1型巨噬细胞。通过显微镜观察冻存活性微粒羊膜条件培养基培养后巨噬细胞形态改变及PCR检测M1型、M2型巨噬细胞标志物基因表达水平的变化来评估冻存活性微粒羊膜条件培养基对巨噬细胞极化的作用。实验结果1.冻存复苏后微粒羊膜和新鲜微粒羊膜中羊膜上皮细胞的活性分别为73.08%±2.95%和92.94%±2.27%。H&E染色结果显示复苏后单层羊膜上皮细胞紧贴于厚基底膜层,与新鲜微粒化羊膜结构类似。进一步扫描电镜结果显示复苏后羊膜上皮细胞膜结构保存完好,未见膜孔洞形成。人生长因子抗体芯片结果显示冻存活性微粒羊膜条件培养基高表达AR,EGFR,CSF2,CSF3,HB-EGF,HGF,IGFBP-2,IGFBP-3,CSF1R,NT-3,PDGFR和TGF-β1。人趋化因子抗体芯片结果显示冻存活性微粒羊膜条件培养基高表达GRO,IL-8,MCP-1和MIP-1b。人炎症因子抗体芯片结果显示冻存活性微粒羊膜条件培养基高表达IL-6,IL-8,MCP-1,MIP-1b,TGF-β1,TNF-β和TIMP-2。2.1.冻存活性微粒羊膜移植后7天,创面湿而红润,微粒羊膜存活良好。创面第21天冻存活性微粒羊膜组大部分创面完全愈合,平均创面愈合率为94.64%±2.67%,明显高于冻存去细胞微粒羊膜组(80.52%±3.85%,p<0.001)和空白对照组(68.40%±5.37%,p<0.001)。冻存活性微粒羊膜组及冻存去细胞微粒羊膜组中羊膜微粒充填于真皮基质,真皮厚度明显高于空白对照组,2个月左右大部分羊膜微粒发生降解。2.2.创面第5天,羊膜上皮细胞在创面存活良好,大部分紧密贴附于羊膜基质并显示出复层生长的趋势,仅非常少量羊膜上皮细胞发生迁移。创面第7天少量羊膜上皮细胞开始出现凋亡,第28天时创面未检测到人羊膜上皮细胞。2.3创面第5天冻存活性微粒羊膜组创面F4/80阳性巨噬细胞数目明显高于其他两组,但第10天时明显低于其他两组且M1型巨噬细胞比例显著低于其他两组、M2型巨噬细胞比例显著高于其他两组。创面第10天冻存活性微粒羊膜组创面促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6表达显著减少,而促创面愈合因子TGF-β1、IGF-1和VEGF表达显著增高。2.4创面第5天冻存活性微粒羊膜组外周血内皮祖细胞数量明显高于其他两组,且创面CD34阳性细胞数量也显著增高。肉眼观显示创面第14天和21天冻存活性微粒羊膜组血管化明显高于其他两组,这一结果与免疫组化检测创面新生血管数量结果一致。3.IFN-γ+TNF-α诱导巨噬细胞伸出突起而冻存活性微粒羊膜条件培养基能诱导巨噬细胞伸长向M2型巨噬细胞形态转化,进一步PCR结果显示冻存活性微粒羊膜条件培养基能上调CD206基因表达而下调CCR7基因表达。冻存活性微粒羊膜条件培养基可促进巨噬细胞迁移而对其增殖无影响。同时,冻存活性微粒羊膜条件培养基促进人脐静脉内皮细胞、人原代成纤维细胞和表皮细胞迁移、增殖及增强人脐静脉内皮细胞体外成小管能力。实验结论1、人新鲜羊膜以微粒化形式并采用无血清冻存液STEM-CELLBANKERTM冻存能完好保存羊膜天然结构、羊膜上皮细胞活性及羊膜生物活性因子;2、局部应用冻存活性微粒羊膜能显著促进糖尿病小鼠创面愈合,且羊膜上皮细胞移植后创面存活率高;3、冻存活性微粒羊膜主要通过调控创面炎症反应、招募干细胞、促进新生血管化促进糖尿病创面愈合,同时羊膜基质能作为真皮替代物快速重构真皮结构。