前言癫痫是一种大脑神经元放电异常的复杂的神经系统性疾病,发病率为0.5-1%影响着世界上7000多万病患者。癫痫具有复杂的发病机制,且其机制尚未明确。Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（Calcium/Calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKII）作为Ca²⁺/钙调蛋白（Calmodulin,CaM）调节蛋白家族中的一个主要成员,其在多种疾病的病理生理过程中发挥重要的作用。研究表明,CaMKII磷酸化活性在不同癫痫模型中下降,我们前期研究结果表明遗传性癫痫震颤大鼠（Tremor,TRM）海马中磷酸化CaMKⅡ蛋白表达下调。KN93为CaMKII特异性抑制剂,可抑制CaMKII磷酸化活性。到目前为止,KN93对神经细胞的毒性作用与机制并不清楚。电压门控钠通道（Voltage-gated sodium channel,VGSC）是常见且重要的钠通道类型之一,其由一个α亚基和多个β亚基（β₁-β₄）构成,α亚基具有10种不同的亚型（Na_V1.1-1.9,Nax）,其中Na_V1.1、Na_V1.2、Na_V1.3和Na _V1.6这4种亚型在中枢神经系统中大量分布。VGSC作为启动神经元的动作电位,同时VGSC也是抗癫痫药物的主要治疗靶点。我们既往研究和他人研究表明病人癫痫脑组织和癫痫动物模型VGSC的蛋白表达上调,VGSC功能亦发生变化。同时,我们前期发现侧脑室给予KN93的自发性癫痫大鼠海马组织中磷酸化CaMKⅡ蛋白表达进一步下调,Na_V1.2蛋白表达上调,表明CaMKⅡ抑制改变VGSC的表达,可能与癫痫的发病机制或继发表现相关。到目前为止,CaMKⅡ活性抑制对神经细胞VGSC的作用仍不清楚。丝裂原活化蛋白激酶又称促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK或MAP激酶）是特定于氨基酸、丝氨酸和苏氨酸的特异性蛋白激酶。MAPK参与指导细胞对多种刺激的反应,例如有丝分裂原、渗透压、热休克和促炎细胞因子。它们调节细胞功能,包括增殖、基因表达、分化、有丝分裂细胞存活和细胞凋亡。c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）是MAPK的重要通路靶点之一,最初鉴定为激酶结合并磷酸化c-Jun的上丝氨酸其转录激活结构域内的-63和Ser-73。它们属于丝裂原活化蛋白激酶家族,并控制由细胞因子、紫外线照射、热休克和渗透压休克等原因导致的应激反应,并在细胞凋亡途径中起关键作用。研究表明哺乳动物和昆虫的炎症反应可通过两种MAP激酶激酶MKK4和MKK7进行活化,并且可以通过Ser/Thr和Tyr蛋白磷酸酶使JNK失活。本研究使用磷酸化的JNK抑制剂（p-JNK抑制剂）SP600125,我们前期研究中发现TRM海马组织p-JNK表达升高,CaMKII活性抑制后TRM海马组织p-JNK表达进一步升高,但JNK通路如何影响KN93对神经细胞的作用并不明确。因此,本研究通过细胞培养、分子生物学方法揭示KN93对大鼠原代培养神经元和PC12的作用及其机制,明确KN93对神经细胞的毒性作用及KN93诱导的毒性作用和p-JNK通路之间的关系,旨在进一步阐明癫痫的发病机制,为癫痫离子通道特异性药物的筛选提供初步的理论基础和实验依据。实验方法1.传代细胞（PC12细胞系）培养将冻存的细胞种子37℃复苏30分钟,倒入具有培养基的培养皿中,每6-12h观察细胞形态。当细胞长满培养皿时开始传代,倒出培养皿中的细胞液,缓慢倒入预热的无血清培养液清洗三次。倒入胰酶消化3-5分钟（随时观察细胞状态）,消化完全后倒入有血清培养液终止消化,并传至新的培养皿中。取长好细胞,重复细胞传代过程,消化完全后打入2 mL有血清培养液,将细胞液转移至5 mL EP管中封好,离心后取细胞沉淀与900μL牛血清马血清混悬液和100μL冻存液吹打细胞至均匀,转移至细胞冻存管,4℃30分钟,-20℃2小时,-80℃梯度冻存。2.原代海马神经元培养出生2天内新生Wistar大鼠幼崽,麻醉并断头,迅速取出大脑放入4度存放的Hank’s液中浸泡。在显微镜冰浴状态下迅速解剖海马,取用冷藏的5 mL细胞培养液（Hyclone DME/F-12）清洗海马组织三次。使用1-2 mL果胶酶消化海马组织,轻轻吹打1-2次,取出细胞悬液将剩余组织再次使用果胶酶消化,直至消化完全。将消化后细胞与海马神经元培养液均匀混合并计数进行铺板。24小时贴壁后每隔一天半数体积换液。培养7-9天观察神经元状态后做实验。3.免疫印迹（Western Blot,WB）实验法取出提前铺好的六孔细胞培养板,每板加150μL细胞裂解液,细胞刮刀均匀刮培养板至细胞完全与裂解液混合,静置30分钟,将细胞裂解液吸取至1.5 mL EP管中,12000转20分钟4℃离心,将细胞膜细胞器等杂质离心至管底。转移上清至新的1.5 mL EP管中,测蛋白浓度。按照样品与Loading Buffer 4:1混匀后放置样品加热器中加热10分钟,使蛋白变性。制胶后进行电泳,75 V低压电泳30分钟后切换电压110 V电泳1小时。Marker电泳至玻璃板底部停止电泳,取出胶。制转膜三明治,放入冰袋,避光湿转大分子300 mA 6个小时,小分子200 mA 90分钟。封闭后膜孵育VGSC亚基兔源一抗抗体和凋亡相关指标一抗抗体,TBST清洗三次每次10分钟,孵育羊抗兔二抗,TBST清洗三次每次10分钟。1:1配置ECL发光液,进行发光。4.CCK8（Cell Counting Kit 8）细胞毒性实验重复细胞传代过程,在96孔板中接种细胞悬液,每孔种5000-7000个细胞（注意混匀）。细胞贴壁后,按照0、0.1、0.3、1、3、10、30、100的浓度梯度给药24小时,终浓度体积为100μL。按1:10加入CCK-8试剂,在细胞培养箱内继续孵育2小时,用酶标仪测定在450 nm处的吸光值,如果吸光度值不达标每30分钟再测一次。CCK8细胞存活率实验通过吸光度值按照细胞存活率（%）=[A（加药）-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）]×100%的公式进行计算。5.流式细胞术冰浴条件下,用胰酶消化细胞,终止消化后离心取细胞沉淀。取4 mL Binding buffer放入36 mL去离子水中混匀,10倍稀释Binding buffer试剂。加900μL PBS洗细胞,将悬液转移到1.5 mL的EP管中,1000转离心5分钟。离心后去除上清,加950μL Binding buffer轻轻吹打再次离心1000转5分钟,以上过程重复两次,取出离心后EP管去除上清,每管保留100μL处理后的细胞悬液。除PI单染和空白对照组,每管加5μL的FITC（绿）,避光染色10分钟。每管加5μL PI（红）,注意混匀,染完后1小时内测。加300μL PBS和样品于流式小管中,标记样本,测量前吹打匀。染色及数据统计:PI表示晚期凋亡,FITC染色表示早期凋亡。Q4代表早期凋亡;Q2代表晚期坏死;Q1代表损伤,一般以Q2+Q4为主。6.免疫荧光培养细胞时先每皿铺放一张细胞爬片（WBS）,取培养好的神经元,4%多聚甲醛固定30分钟,并用PBS清洗10分钟三次。3%BSA封闭液封闭30分钟,取300倍稀释的NeuN一抗稀释液（Abcam）50μL 4℃湿盒中孵育一夜。第二天PBS清洗10分钟三次,100倍稀释FITC荧光二抗（中杉金桥）50μL敷育两小时。PBS清洗10分钟三次后,DAPI原液染核10分钟,再次重复清洗步骤,取出处理好的细胞爬片,用甘油封片,荧光显微镜拍摄NeuN与细胞核表达情况。7.统计分析根据Western Blot免疫印迹实验分别将其PVDF膜成像灰度值转换成标准化比值。使用GraphPad 7.0软件绘制对照组,KN93加药组,KN93与TTX共同加药组和KN93与p-JNK共同加药组。免疫荧光通过Image J进行统计计算。使用SPSS软件评估数据的显著性差异,统计方法主要为学生氏t检验和方差分析,数据为平均值+标准误,P<0.05认为具有统计学差异,P<0.01认为具有显著性统计学差异。结果1.KN93给药后24小时对细胞生存率与形态学的影响利用CCK8实验法,应用KN93按照0、0.1、0.3、1、3、10、30、100μmol的浓度梯度给药24小时后进行浓度效应曲线测定。细胞存活率随KN93浓度升高而下降,当KN93浓度为25μmol时,细胞存活率为50%即细胞半数致死剂量并具有统计学意义（n=6）。经过KN93给药后,原代培养海马神经元中通过免疫荧光染色法发现NeuN染色的阳性细胞百分比均有下降,从细胞形态学角度证明KN93能导致细胞死亡。2.KN93给药后24小时对细胞凋亡的影响在此基础上,通过Western Blot实验法对凋亡相关的几个通路蛋白进行验证,发现Caspase-3蛋白表达增加,凋亡通路其他相关蛋白（BCL-2,Bax,Cytochrome-c）也体现出下降或升高的趋势,证明KN93给药后24小时激活凋亡通路,诱导细胞凋亡（n=6）。根据蛋白层面表达,对实验组和对照组利用流式细胞术观察细胞凋亡程度,发现25μmol KN93给药24小时后细胞达到半数凋亡（n=6）。3.KN93给药后24小时对VGSC的影响为了进一步了解24小时KN93给药诱导细胞凋亡并对神经系统的影响,我们研究其对VGSC四个亚型Na_V1.1,Na_V1.2,Na_V1.3,Na_V1.6的作用。电压型门控VGSC四个亚型KN93给药处理24小时后,我们从蛋白层面发现表达变化。与对照组相比Na _V1.1与Na_V1.2两个亚型上调,Na_V1.6亚型下调,Na _V1.3有微弱改变但不具有统计学意义。这一现象表明钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ的抑制剂KN93给药后24小时改变VGSC的表达。4.p-JNK信号通路参与CaMKⅡ抑制剂KN93诱导的细胞凋亡KN93给药后24小时可作用于p-CaMKII通路,p-JNK为p-CaMKⅡ通路中的下游蛋白,我们应用CCK8实验法分别得出p-JNK抑制剂,p-JNK抑制剂与KN93在不同浓度时间条件下对细胞存活率的影响。通过免疫荧光技术在细胞形态表达层面观察p-JNK抑制剂对细胞凋亡的影响。利用Western Blot实验法发现凋亡代表性蛋白Caspase-3表达下降其他与凋亡通道相关的上下游抗体蛋白也均有变化,且p-JNK抑制剂（SP600125）可抑制KN93诱导的p-JNK表达增加。5.p-JNK信号通路参与CaMKⅡ抑制剂KN93诱导的VGSC表达异常我们应用免疫印迹实验研究CaMKⅡ抑制剂KN93在蛋白表达层面对VGSC四个亚型Na _V1.1、Na_V1.2、Na_V1.3和Na _V1.6的影响。与KN93给药后24小时组比较,p-JNK抑制剂可以降低Na_V1.1和Na_V1.2表达,升高Na_V1.6表达。结论与研究意义首先,我们应用CCK8测试不同给药浓度下的细胞存活率,之后应用荧光染色染色和Western Blot免疫印迹实验法分别在细胞形态层面和蛋白表达层面观察给药对细胞凋亡的影响。实验发现KN93给药后24小时可诱导细胞凋亡,而不同VGSC亚型对KN93给药后24小时呈现不同表达。为了进一步探究KN93给药后24小时作用机制,应用p-JNK抑制剂验证钙调蛋白激酶所在通路机制。数据显示,p-JNK抑制剂对KN93给药后24小时导致的细胞凋亡具有逆转作用,并对VGSC不同亚型具有不同影响,说明p-JNK可影响VGSC表达与细胞凋亡。综上所述,我们关注KN93给药后24小时对VGSC的影响与p-JNK抑制剂对其细胞凋亡的逆转和作用机制。在下一步的工作中,我们进一步研究KN93给药后24小时诱导的毒性机制。综上,本研究揭示KN93毒性作用,初步表明p-JNK通路参与毒性作用机制,进一步揭示癫痫发病机制并为寻找抗癫痫药物的新靶点提供理论依据。