副猪嗜血杆菌是定殖于猪上呼吸道的一种机会性致病菌,可以引起猪的Glasser’s病,临床上主要表现为浆液性纤维素性胸膜炎、关节炎、脑膜炎和肺炎,给畜牧业的发展造成了巨大的经济损失。达氟沙星作为氟喹诺酮类药物,具有抗菌活性强、抗菌谱广、吸收快、生物利用度高等特点,临床上主要用于治疗猪、牛、羊、鸡等各种动物的呼吸道感染。泰乐菌素是16元环大环内酯类抗生素,常用于猪呼吸道疾病的治疗。目前由于抗生素在临床上的不合理或不正当使用以及其它环境条件的应激等,很多地区的副猪嗜血杆菌均表现出了不同程度的耐药性。而副猪嗜血杆菌相关的耐药检测和判定标准至今尚未建立,临床上主要参考CLSI公布的嗜血杆菌属或胸膜肺炎放线杆菌的相关标准。因此,本课题参考CLSI和EUCAST中折点制定的方法,建立了副猪嗜血杆菌的耐药判定标准,以期有效的监测细菌耐药性的产生和更好的指导临床用药,并且为折点的制定提供科学的思路。1 达氟沙星和泰乐菌素对副猪嗜血杆菌的野生型临界值(CO_WT)的制定本试验从临床病变的肺中分离到了35株副猪嗜血杆菌,结合实验室中保存的以及徐晓娟老师赠送的共143株副猪嗜血杆菌。参考CLSI推荐的琼脂稀释法测定了143株副猪嗜血杆菌对达氟沙星和泰乐菌素的最小抑菌浓度（MIC）,得到达氟沙星和泰乐菌素对副猪嗜血杆菌的MIC₅₀分别为4μg/m L和16μg/m L,MIC₉₀分别为16μg/m L和32μg/m L。将得到的MIC数据带入Ecoffinder软件,进行非线性回归模拟,得到不同置信区间下的野生型临界值。最终取95%置信区间下的MIC为最终的野生型临界值。得到达氟沙星和泰乐菌素对副猪嗜血杆菌的CO_WT分别为16μg/m L和64μg/m L。可初步判断副猪嗜血杆菌对达氟沙星更敏感,故主要以达氟沙星为研究对象,建立达氟沙星对副猪嗜血杆菌的耐药判定标准。2 达氟沙星对副猪嗜血杆菌的药效学临界值(CO_PD)的制定及给药方案的确定选择MIC₅₀,MIC₉₀,野生型临界值等5个不同MIC及其附近的81株副猪嗜血杆菌来进行肠杆菌基因间重复序列PCR（ERIC-PCR）分型实验,将筛选得到的18株血清5型的副猪嗜血杆菌进行小鼠毒力试验。选用16 g～20 g健康Balb/c小鼠95只,每个菌株为一组,每组5只,腹腔注射0.5 m L 1×10⁹CFU菌液。观察小鼠死亡情况,筛选出致病性较强的菌株,最终选择MIC₅₀菌株H80来进行PK-PD实验,选择5个不同MIC的菌株H42,H80,H12,H83和H17进行临床治疗实验,制定临床临界值。参考CLSI推荐的微量肉汤稀释法,测定达氟沙星对副猪嗜血杆菌H80在肉汤和肺泡液中的MIC和最小杀菌浓度（MBC）,结果显示在肉汤和肺泡液中的MIC分别为4μg/m L和2μg/m L,MBC分别为8μg/m L和4μg/m L,说明肺泡液中含有某种抗体或者抑菌因子或其它能增强达氟沙星抗菌活性的成分,使得达氟沙星在肺泡液中的抗菌活性高于在肉汤中的抗菌活性;通过平板涂布法测定达氟沙星对副猪嗜血杆菌H80的最小防耐药突变浓度（MPC）为20μg/m L;将副猪嗜血杆菌H80暴露在不同浓度的达氟沙星1 h和2 h后,测定副猪嗜血杆菌与达氟沙星孵育1 h和2 h的抗菌后效应（PAE）,分别为0.59 h～2.38 h和0.86 h～2.95 h;根据MIC测定结果,设置不同浓度的达氟沙星药物分别与副猪嗜血杆菌H80孵育,在不同时间点各取0.1m L进行细菌的涂板计数,绘制达氟沙星对副猪嗜血杆菌的体外杀菌曲线,根据达氟沙星给药后不同时间点肺泡液中的药物浓度,在空白的肺泡液中添加相应浓度的药物,与副猪嗜血杆菌H80孵育,绘制半体内的杀菌曲线。其半体内杀菌曲线与体外的杀菌曲线均随着浓度的增加,杀菌作用明显增强,表现出明显的浓度依赖性,最终选择的PK-PD参数为AUC/MIC。试验选用6头20 kg左右的断奶仔猪,用来建立达氟沙星的血浆药动模型和肺部药动学模型。按2.5 mg/kg b.w.肌肉注射给药后,在0.08 h,0.16 h,0.25 h,0.5 h,0.75h,1 h,1.5 h,2 h,3 h,4 h,6 h,8 h,10 h,12 h,24 h,36 h,48 h采集血液4 m L。通过电子纤维镜技术在0.5 h,1 h,1.5 h,2 h,3 h,4 h,6 h,8 h,10 h,12 h,24 h,36 h,48 h采集肺泡灌洗液（PELF）。根据建立的高效液相检测方法检测不同时间点血浆和肺泡灌洗液中的药物浓度。使用Winnonlin软件中的一级吸收二室模型对获得的数据进行模拟,得到达氟沙星在血浆中的达峰时间(T_max)为0.23±0.07 h,达峰浓度(C_max)为0.67±0.01μg/m L,药时曲线下面积(AUC₂₄)为4.47±0.51 h·μg/m L;达氟沙星在肺泡灌洗液中的T_max为1.61±0.15 h,C_max为3.67±0.25μg/m L,AUC为24.28±2.70 h·μg/m L。根据半体内杀菌曲线的结果,计算达氟沙星在不同浓度下的半体内AUC₂₄/MIC。再用Winnonlin软件中的Sigmoid E_max方程E=E_max-((E_max-E₀)×C^N)/(C^N+EC^N₅₀)模拟,得到E=0,-3和-4（抑菌、杀菌和根除）时,(AUC₂₄/MIC)_ex的数值分别为12.73,28.68和44.38。用蒙特卡洛模拟10000头猪的AUC数据,得到不同的MIC值下AUC₂₄/MIC达到药效学目标的概率,取达标率大于等于90%时的最大MIC为药效学临界值,即肺泡液中达氟沙星对副猪嗜血杆菌的CO_PD为0.5μg/m L;血浆中达氟沙星对副猪嗜血杆菌的CO_PD为0.125μg/m L。将达氟沙星对副猪嗜血杆菌的PK-PD数据和临床菌株的MIC₅₀带入剂量方程Dose=(MIC×(AUC₂₄/MIC)_ex)/fu×CL/F,计算得到不同杀菌作用（抑菌、杀菌和根除）下的给药剂量分别为4.58 mg/kg,10.32 mg/kg和15.97 mg/kg。3 达氟沙星对副猪嗜血杆菌的临床临界值(CO_CL)的制定将试验仔猪（20 kg左右）分为11组,每组6头,共计66头。攻毒菌株选用筛选的5个不同MIC的菌株H42,H80,H12,H83和H17,治疗方案采用PK-PD推荐的给药方案,10.32 mg/kg b.w.,一天2次。以1×10¹⁰CFU的剂量,鼻内注射5株不同的致病性副猪嗜血杆菌,一天2次,攻毒一天。攻毒后密切观察猪只症状,统计实验治愈率。采用三种不同的分析方法对所得的MIC与治愈率进行分析。“Windo W”方法分析得到CO_CL的选择窗为0.125μg/m L～4μg/m L;非线性回归分析表明,当治愈率为90%时,MIC为0.428μg/m L,所推荐的CO_CL小于等于0.428μg/m L;分类与回归树（CART）分析所得的CO_CL小于等于0.56μg/m L。综合上述几种分析方法,CO_CL的范围为0.125μg/m L～0.428μg/m L,结合本实验的MIC分布,选择满足0.125μg/m L～0.428μg/m L范围的最大的MIC作为本实验的CO_CL,即达氟沙星对副猪嗜血杆菌的CO_CL为0.25μg/m L。综合所有实验,已知野生型临界值为16μg/m L,药效学临界值为0.5μg/m L,临床临界值为0.25μg/m L。将这3个临界值带入CLSI公布的折点制定的流程图,符合CO_WT>CO_PD>CO_CL,敏感性折点值等于野生型临界值的值,即可得到达氟沙星对副猪嗜血杆菌的耐药判定标准为16μg/m L。