研究背景和目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年痴呆中最常见的类型。随着中国老年人口比例的日益增加,AD发病率不断攀升,它不仅严重危害老年人的身体和心理健康,同时也给患者家属及社会带来沉重的经济负担。AD是一种神经系统退行性疾病,以进行性记忆力下降、认知功能减退以及行为改变为主要临床表现。其主要病理改变是β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)异常沉积和tau蛋白过度磷酸化导致老年斑(Senileplaque,SP)、神经元纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFT)的形成。目前,AD的临床诊断主要依靠询问病史、临床检查、神经心理学测试、影像学检查以及实验室检查。但是这些方法的灵敏性和特异性都不高,无法明确的诊断AD,尤其在疾病的早期阶段。因此,迫切需要可靠的生物指标用于AD的早期诊断从而尽早实施有效的防治措施。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一种高度保守的小片段非编码RNA,在转录后水平调控基因的表达。以往研究表明,miRNAs在中枢神经系统表达丰富,具有高度的时间和空间特异性,与神经元的形成和分化,以及突触的重塑密切相关。另外,一些研究还证实miRNAs能够借助微小囊泡穿过血脑屏障,释放到外周血中。血清样本具有采样方便、创伤性小的特点,因而在临床应用中依从性更好,检测频次可以更高,是一个非常具有吸引力的生物标志物来源。因此,血清miRNAs作为生物标志物用于AD的早期诊断是非常有前景的。近年来,随着高通量测序技术的发展,研究人员能够从全基因组水平分析血清中的miRNAs,从而寻找到更多与AD发病相关的miRNAs。但是目前还没有应用测序技术寻找血清miRNAs用于AD病情分级和病程监测的研究。因此,本研究最主要的目的就是利用目前最先进的第二代高通量测序技术(Next-Generation Sequencing,NGS)和实时定量 PCR 技术(qRT-PCR)来寻找一组可用于AD早期诊断、疾病分级和病程监测的血清miRNAs生物标志物。本研究通过对AD轻度、中度、重度的患者以及健康对照者血清样本的miRNAs测序,发现了一系列AD相关的miRNAs,通过聚类分析和多组比较的方法筛选出在各组间存在差异的miRNAs,并通过qRT-PCR技术进行扩大样本的验证,得到9种与AD密切相关的血清miRNAs,它们有望作为新的生物指标应用于AD的早期诊断、病情分级以及病程监测。方法1.按照美国国立神经病研究所和老年性痴呆相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)所制定的标准对AD患者进行诊断。根据简易精神状态检查表(MMSE)和临床痴呆评定量表(CDR)对研究对象的认知损害程度进行评估,并根据得分分为健康对照、轻度AD、中度AD、重度AD四组。收集参与者静脉血,并在2小时内提取血清,剔除有溶血的样本。2.运用第二代高通量测序技术分别检测9例健康对者、6例轻度AD患者、7例中度AD患者和6例重度AD患者共28例参与者血清样本的miRNAs表达谱。对测序所得到的数据进行标准化处理,并通过与多种数据库进行比对,去除数据中非miRNAs的RNA序列以及重复序列。将最终得到的miRNAs序列与miRNAs数据库(miRBase 21.0)进行比对,来确定已知miRNAs和新发现的miRNAs。在AD组和健康对照组中对这些miRNAs的表达量进行比较,选出异常表达的miRNAs,再在四组样本中进行多组比较,筛选出与AD发病进程相关的血清miRNAs。3.运用qRT-PCR技术,对上一步中筛选出miRNAs进行大样本验证,扩大的样本共207例,其中健康对照86例,轻度AD31例,中度AD52例,重度AD38例。运用公式2-△△Ct计算异常表达miRNAs的差异倍数,然后将qRT-PCR结果与测序结果进行比较。分析每种异常miRNAs与MMSE得分的相关性。运用二元logistic回归,建立miRNAs联合指标。通过ROC曲线分析,评价所有异常miRNAs及miRNAs联合指标的诊断效能、灵敏度和特异性。将qRT-PCR所得到的miRNAs表达水平在四组样本中进行多组比较,分析它们与AD病情进展之间的关系。应用靶基因分析软件对最终确定的AD相关的异常miRNAs进行靶基因预测,得到miRNAs富集GO信号通路,将异常miRNAs、靶基因、信号通路的对应关系绘制网络调控结构图。结果1.运用单因素方差分析对四组样本进行多组比较,从已标准化的测序数据中筛选出13种表达异常的miRNAs,其中6种miRNAs(hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-181c-3p、hsa-miR-584、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-22-3p 和hsa-miR-148b-5p)表达下调,另外 7 种 miRNAs(hsa-miR-221-3p、hsa-miR-106b-3p、hsa-miRNA-144-5p、hsa-miR-6119-5p、hsa-miR-1388-3p、hsa-miR-1246 和hsa-miR-660-5p)表达上调。2.扩大样本量对筛选出的13种miRNAs进行qRT-PCR验证,然后与测序结果进行比较,得到9种异常表达模式相同的血清miRNAs。3.ROC曲线分析表明这9种miRNAs均有一定潜力作为生物标志物用于AD的诊断,它们的曲线下面积在70.0%到85.3%之间,有足够的能力区分AD患者和健康对照者。其中hsa-miR-22-3p具有做好的灵敏度(81.8%)和特异性(70.9%)。4.运用二元logistic回归建立miRNAs最佳联合指标(hsa-miR-26a-5p/hsa-miR-181c-3p/hsa-miR-22-3p/hsa-miR-148b-5p/hsa-miR-106b-3p/hsa-miR-6119-5p/hsa-mi,R-660-5p),运用ROC曲线评价其诊断效能,发现联合指标具有更高的曲线下面积(98.6%)、灵敏度(93.4%)和特异性(98.8%)。5.分别对这9种miRNAs与MMSE得分进行相关性分析,结果显示:有5种表达下调的 miRNAs(hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-181c-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-148b-5p)与MMSE得分具有正相关性;而另外4种表达上调的 miRNAs(hsa-miR-106b-3p、hsa-miR-6119-5p、hsa-miR--1246、hsa-miR-660-5p)与MMSE得分具有负相关性。6.对健康对照、轻度AD、中度AD、重度AD四组中miRNAs表达水平进行多组比较,分析它们与AD病情进展之间的关系。多组比较分析示,9种miRNAs均存在显著的统计学差异,再进行Bonferroni’s post-hoc检验的两两比较,部分miRNAs不仅表现出AD各组与健康对照组间的差异,而且在AD各组间同样具有显著的统计学差异。7.运用GeneOntology(GO)分析的方法对9种异常miRNAs进行靶基因预测。发现它们的靶基因主要富集在神经系统发育和神经元细胞体的两个GO分类中。在与神经系统发育相关的分类中,9种miRNAs均参与其中,预测得到的相关靶基因共135个;在与神经元细胞体相关的分类中,有8种miRNAs参与其中,预测得到相关的靶基因共40个。结论研究中发现了 9种与AD病情分级密切相关的血清miRNAs(hsa-miR-26a-5p,hsa-miR-181c-3p,hsa-miR-126-5p,hsa-miR-22-3p,hsa-miR-148b-5p,hsa-miR-106b-3p,hsa-miR-6119-5p,hsa-miR-1246 和 the hsa-miR-660-5p),它们有望作为血清学生物标志物用于AD的早期诊断。未来将建立AD相关血清miRNAs库,并与现有临床检测方法一同建立一种更为综合的诊断方式和治疗策略,为AD患者的预后提供重要帮助。