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背景与目的胃癌、肝癌是最为常见的消化道恶性肿瘤,在中国新增病例和死亡人数均居首位。目前,手术、化疗、放疗等方法是治疗胃癌和肝癌的主要方式,但治疗效果差。基因诊治作为一种新兴的诊治手段,在癌症的诊疗及预后评估中有着明显的优势,有可能是未来攻克癌症的重要辅助手段。因此,对与肿瘤相关基因功能的研究就显得尤为重要。探究胃癌、肝癌发生与发展过程中涉及基因的功能从而实现对胃癌和肝癌的基因诊治,有可能是解决胃癌和肝癌临床瓶颈问题的希望所在。肿瘤转移、复发是癌症的重要恶性标志,该过程包括细胞与细胞间粘附的降低、细胞间及与细胞外基质粘附能力的增强、对细胞外基质的降解增强等。在肿瘤发展过程中,细胞能够通过上皮细胞间充质化(EMT)来获得细胞的恶性表型。EMT过程需要对细胞连接、由整合素受体介导的细胞基质位点、局部黏着斑的形成等进行改变,其中局部黏着斑激酶(FAK)是扮演重要角色的关键蛋白之一。本室以往研究均提示FAK在多种恶性肿瘤细胞／组织中高表达,并且与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。为了揭示FAK与胃癌和肝癌恶性病程发展的关系,评估其在胃癌和肝癌发展过程中的重要性以及作为胃癌和肝癌诊治的靶分子的潜在价值,本研究应运RNA干扰技术下调FAK的表达水平,研究了FAK与胃癌细胞(SGC-7901)和肝癌细胞(SMMC-7721)的增殖力、运动力的关系以及与某些相关基因的潜在关系。方法1.在NCBI数据库检索FAK基因的基因信息,在线设计针对FAK的siRNA,BlastHit检测特异性后克隆至质粒pU6H1-GFP,构成pU6H1-GFP/FAK-siRNA。2.采用磷酸钙转染法,将制备完成的pU6H1-GFP/FAK-siRNA导入人胃癌细胞SGC-7901和肝癌细胞SMMC-7721,以错义对照siRNAscr和野生细胞作为对照,转染72h后评估细胞转染效率,采用RT-PCR和Western blot确认抑制效率。3.采用损伤修复法和TransWell小室实验检测下调FAK的表达后对SGC-7901和SMMC-7721细胞的运动能力的影响。4.采用流式细胞仪检测下调FAK表达后对SGC-7901和SMMC-7721细胞周期的影响。5.以RT-PCR、Western blot法检测下调FAK表达后,Src、Ras、Ape1、Rgnef的表达水平。6. 以细胞免疫荧光法检测下调FAK表达水平后,SGC-7901和SMMC-7721细胞Src、Ras、Apex1、Rgnef的分布以及表达水平。7. 以生物信息学方法分析FAK、Src、Ras、Apex1、Rgnef与胃癌和肝癌发生发展潜在的关系。结果1.成功构建了靶向FAK的siRNA重组质粒,磷酸钙法转染效率达80%以上。2. FAK siRNA质粒能够显著抑制癌细胞中FAK基因的表达水平。3.损伤修复法、Trans Well及流式细胞仪结果提示FAK基因表达下调后SGC-7901细胞运动能力明显降低,细胞周期被阻滞于G1期,SMMC-7721被阻滞在S期,但未发现明显的凋亡峰。4. RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光结果显示抑制FAK表达能够显著抑制的Src、Ras、Apex1、Rgnef的mRNA和蛋白表达水平。结论1.下调FAK的表达水平可以有效抑制SGC-7901、SMMC-7721细胞运动和增殖能力,胃癌细胞SGC-7901被迟滞在G1期,肝癌细胞被迟滞在S期。这说明FAK对肿瘤细胞的转移、侵袭等癌症发展关键环节有重要的促进作用。2. RT-PCR、Western blot、免疫荧光实验结果表明FAK基因的表达与Src、Ras、 Apex 1、Rgnef的表达成正相关。3.生物信息学分析表明在胃癌和肝癌临床病例的统计数据中,FAK、Src、Ras、 Apex1、Rgnef对癌症的发生发展意义重大。4.本实验从研究癌细胞恶性表型及相关基因的角度说明FAK基因参与胃癌和肝癌细胞的发生和发展,提示FAK基因对于胃癌和和肝癌的基因诊治具有重要价值。