牙周病引起的牙周组织缺损,是造成人类失牙的主要原因,严重危害了人类的生存健康。防治牙槽骨吸收一直是口腔医学领域的热门课题,已开展的牙周引导组织再生术(guided tissue regeneration, GTR)、生长因子诱导及釉基质蛋白(enamel matrix protein, EMP)的局部应用等治疗方法均取得了前所未有的效果,但尚未达到人类所期望的目标。随着组织工程学理论和技术的飞速发展,为牙周组织再生研究提供了新的思路。2004年Seo等人第一次从人牙周膜组织中分离出了多能干细胞,为牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)的存在提供了直接的证据。这些细胞能够表达间充质干细胞的特异性标志——STRO-1和CD146,并且高表达腱细胞特异性转录因子Scleraxis。 PDLSCs属于成体干细胞(adult stem cells, ASC),具有ASC的特点,大量研究显示PDLSCs能够自我更新并在体、内外适当的诱导条件下分化为成骨细胞、成牙骨质样细胞以及脂肪细胞,PDLSCs的多向分化潜能和牙周高相关性使其成为牙周组织工程理想的种子细胞。牙周再生治疗的另一关键因素为促干细胞定向诱导分化的药物,目前研究已证实骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、EMP、转化生长因子(transforming growth factor, TGF)、血小板衍生因子(platelet-derived endothelial growth factor, PDGF)、雌激素等具有明确的骨向诱导作用。其中雌激素替代疗法已在临床广泛应用,但是长期使用雌激素会极大地提高乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等的发病率。而植物类雌激素葛根素有效地弥补了这一缺陷,它能够发挥雌激素样作用如促进骨密度增加和骨矿沉积。葛根素的英文名为puerarm,化学名为8-β-D-葡萄吡喃糖-4,7-二羟基异黄酮,在4位和7位各有一个羟基,这两个羟基与雌激素活性密切相关,其中4位羟基是与雌激素受体(estrogen receptor, ER)相结合的部位。近年来,国内越来越多的学者开始探索葛根素在骨代谢方面的作用：蔡花等研究表明葛根素对脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)增殖及成骨分化有促进作用；李斌斌等将葛根素分别作用于成骨细胞和破骨细胞发现葛根素通过抑制骨吸收刺激骨形成来调控骨代谢,其中抑制骨吸收的效果较强；金为旭将葛根素注射于拔牙窝周围发现其能够抑制剩余牙槽嵴的吸收并保存牙槽嵴的高度；郑高利等研究了葛根异黄酮对去卵巢大鼠骨矿密度和骨强度的影响,发现去卵巢大鼠口服葛根异黄酮后,全身骨矿含量、骨矿密度和骨生物力学强度均有不同程度的改善,认为葛根异黄酮对去卵巢引起的大鼠骨质疏松症具有明显的防治作用,雌激素样作用是其主要作用机理。虽然已明确葛根素对多种成骨前体细胞具有骨性诱导作用,但关于葛根素对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs)成骨分化的调控作用尚未见报道。因此,本实验拟探讨葛根素对hPDLSCs的成骨分化的影响,为其应用于临床防治牙槽骨吸收以及组织再生工程奠定理论基础。第一章hPDLSCs的分离培养和鉴定目的：体外分离、培养hPDLSCs,并进行鉴定。方法：1.分离、培养hPDLSCs在供者知情同意的前提下,收集12-16岁因正畸拔除的双尖牙,所选牙齿均无龋坏、根尖周疾病及牙周炎。将新鲜拔除的牙齿在超净工作台内冲洗干净后,仔细刮取根中1/3的牙周膜组织收集于离心管中,加入1ml浓度为6mg/ml的胶原酶和1ml浓度为8mg/ml的Dispase酶(此为四颗牙用量),混匀后于37℃水浴中消化1h左右,1000rpm离心5min后弃上清,细胞重悬于含10%胎牛血清的a-MEM培养基中,置于37℃、5%C02培养箱中培养。待人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells, hPDLCs)传至第三代,采用免疫磁珠法分离hPDLSCs:将约1×106/ml的hPDLCs与STRO-1单抗4℃孵育1h,与磁珠4℃孵育30min,在磁力架作用下筛选出STRO-1+hPDLCs并接种于12孔板内,置37℃、5%C02孵箱中培养。2. hPDLSCs的鉴定通过免疫荧光法检测培养细胞的干细胞表面标志STRO-1和CD146以及波形丝蛋白和角蛋白的表达情况,对细胞来源进行鉴定。结果：1. hPDLSCs形态学特征：用免疫磁珠法筛选出的hPDLSCs,接种于12孔板,约两周长满孔底的80%。hPDLSCs形态与hPDLCs相似,为梭形、多角形或不规则形,呈旋涡状或放射状排列。筛选前后分别进行细胞计数,结果显示STRO-1+细胞约占细胞总数的2%。2.免疫荧光染色结果：免疫荧光法检测示筛选出的细胞STRO-1、CD146均呈阳性表达,提示其具有干细胞特性。角蛋白(Cytokertin)呈阴性表达,波形丝蛋白(Vimentin)呈阳性表达,说明筛选出的细胞为中胚层来源的间充质细胞,无外胚层来源的细胞污染,可用于进一步的研究。第二章葛根素对hPDLSCs增殖活性的影响目的：检测实验组所选葛根素浓度对hPDLSCs是否造成毒性作用。方法：1.配制实验组葛根素培养基：参考以往的研究选择0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L这三个浓度作为实验组。将葛根素粉末溶解于DMSO后加入a-MEM培养基中配制成相应浓度的葛根素培养基(DMSO含量低于1%)。未加葛根素的a-MEM培养基作为空白组。2.采用MTT法检测不同浓度葛根素对hPDLSCs增殖活性的影响,鉴定实验组所选浓度是否对细胞产生毒性作用。结果：MTT法检测显示,hPDLSCs在0.01mmol/L、0.1mmol/L和1mmol/L葛根素作用24h后,各实验组OD值均大于空白组,且0.01mmol/L组差异有统计学意义。提示0.01mmol/L葛根素有促进hPDLSCs增殖作用,而其他两浓度组对细胞未产生毒性作用。第三章葛根素对hPDLSCs成骨分化的影响目的：探索葛根素对hPDLSCs成骨分化的作用。方法：1.设置实验组：分别含0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L葛根素的a-MEM培养基；空白组：不含葛根素的a-MEM培养基；阳性对照组：含β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C、a-MEM的成骨诱导培养基。2.采用免疫荧光法对实验组葛根素诱导7d和14d后的细胞分别进行骨化标志蛋白Ⅰ型胶原酶(collagen-Ⅰ, COL-Ⅰ)、骨桥蛋白(osteopontin, OPN)染色,初步鉴定葛根素对hPDLSCs是否具有成骨诱导作用。3.采用ALP试剂盒检测实验组、空白组和阳性对照组培养7d后细胞碱性磷酸酶(alkalinephosphatase, ALP)的分泌情况。4.采用茜素红染色法检测实验组、空白组和阳性对照组培养14d后矿化结节的形成情况,以进一步确定葛根素对hPDLSCs的成骨诱导作用。5.运用qRT-PCR的方法,分别检测实验组、空白组和阳性对照组培养7d和14d后成骨相关基因ALP和骨钙蛋白(osteocalcin, OCN)的表达量的变化,从分子水平明确葛根素对hPDLSCs成骨分化的诱导作用。结果：1.免疫荧光染色显示实验组葛根素作用7d后骨化标志蛋白COL-I呈阳性表达,细胞发出明亮的红色荧光。葛根素作用14d后OPN呈阳性表达,而空白组和PBS阴性对照组均呈阴性表达,提示葛根素可使hPDLSCs向成骨细胞分化。2.ALP试剂盒检测实验组、空白组和阳性对照组培养7d后细胞ALP分泌水平,结果显示：与空白组相比,0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L葛根素组ALP浓度均明显升高,差异具有统计学意义,与阳性对照组相比差异则不显著,葛根素作用后骨化标志蛋白ALP水平的升高提示葛根素能够促进hPDLSCs的骨向分化。3.实验组、空白组和阳性对照组细胞培养14d后进行茜素红染色,结果显示,实验组及阳性对照组均见大量橘红色矿化结节形成,而空白组未见矿化结节形成。其中0.1mmol/L葛根素组与阳性对照组的矿化结节大小及数量相当,但0.01mmol/L和1mmol/L葛根素组的矿化结节数少于阳性对照组。矿化结节的形成是成骨晚期重要的标志性变化,本实验茜素红染色结果进一步表明葛根素可诱导hPDLSCs向成骨细胞分化。4. qRT-PCR法检测实验组、空白组和阳性对照组培养7d和14d后成骨相关基因ALP和OCN mRNA表达量的变化,结果显示,ALP表达变化为：在加药7d后各浓度葛根素组和阳性对照组均呈上调趋势,其中0.1mmol/L组较其他两个浓度组上调显著,为空白对照组的4.8倍,但仍不及阳性对照组,在加药14d后各浓度葛根素组的ALP表达量与空白对照组相比未见明显变化,而阳性对照组仍表现出较高的表达水平。OCN表达变化为：在加药7d后各组OCN表达量没有明显变化,在加药14d后各浓度葛根素组和阳性对照组OCN表达量均显著上调,其中0.1mmol/L组在实验组中上调最为显著,为空白对照组的5.6倍,基本与阳性对照组持平。这一结果从mRNA水平证明葛根素能够促进hPDLSCs的成骨分化,且0.1mmol/L的葛根素是诱导hPDLSCs向成骨细胞分化的最佳浓度。全文结论：1.葛根素在适宜的浓度下,可促进hPDLSCs的增殖。2.葛根素诱导后,hPDLSCs细胞内的成骨矿化相关蛋白的表达增强。3. hPDLSCs在葛根素的诱导下向成骨细胞分化的潜能明显增强,但不及成骨诱导液的骨化作用。