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实验目的：白血病是起源于造血干或祖细胞水平的一种恶性克隆性造血系统疾病,其发病率在各种肿瘤中占第六位,严重威胁着人民的生命健康。但由于具体发病机制至今尚不完全清楚,因此治疗效果仍然不尽如人意。本研究拟通过建立并优化非照射的白血病小鼠模型,系统深入的研究正常造血干／祖细胞(hematopoietic stem cell/Progentior stem cell, HSC/HPC)在急性T淋巴细胞白血病(acute T lymphoblastic leukemia, T-ALL)发病过程中的动力学变化及受抑规律,通过基因组学和生物信息学方法,提出白血病发生中正常造血受抑的可能机制；并对在此异常的白血病环境下,白血病细胞的迁徙和定位进行追踪,最终揭示并阐明白血病发病过程中,正常HSC/HPC与LSC的相互消长变化规律,以及二者竞争性生长的可能机制,为白血病病程预测和有效干预提供新的科学依据和治疗策略。实验方法：为了明确白血病环境对正常HSC/HPC的影响,我们采用非照射的小鼠模型来进行研究。非照射白血病模型它能够更好的体现出白血病的发病机制,能够反映出白血病细胞是如何侵入、抑制并最终破坏机体的正常防御体系,而在这一过程中对于白血病细胞与正常HSC/HPC以及微环境间的相互作用关系及影响具有重要的研究意义。首先构建由过表达Notchl基因胞内段(Intracellular domain of NOTCHl, ICN1)诱发的照射型T-ALL白血病模型。利用用含ICN1-GFP序列的MSCV载体与逆转录病毒包装蛋白质粒pKat、CMV-VSVG在Lipofectamine2000的作用下共转染293T细胞,48h以及72h时收取病毒上清感染B6.SJL小鼠的Lin-细胞,然后将感染好的细胞移植致死剂量照射的B6.SJL小鼠,约50天小鼠发病。接下来我们通过给非照射小鼠移植原代白血病病发小鼠的白血病细胞来构建非照射白血病模型。流式细胞仪检测白血病发展过程中HSC、HPC以及相关造血细胞的动力学变化情况；利用流式细胞仪分选白血病环境中的骨髓正常造血细胞进行功能研究,通过CFC (colony-forming cell assay)与竞争性骨髓移植(competitive bone marrow transplantation, cBMT)实验来评估白血病环境对于残留的正常HSC造血重建能力的影响。为了能够更好的了解这一过程,找出参与的基因及可能的分子机制,接着我们进一步实施了基因芯片和细胞因子芯片的分析。流式分选得到高纯度的LSK细胞进行全基因组表达谱芯片的研究,来确定白血病环境对于正常HSC在基因水平上的影响；同时收集白血病病发小鼠的血清以及骨髓腔积液进行Cytokine Array的分析,来研究白血病细胞对机体以及骨髓腔环境所造成的影响。此外,为了研究白血病细胞在白血病发生发展过程中的作用及对正常HSC/HPC的影响,我们进行了白血病细胞侵袭骨髓的动力学实验,主要是通过双光子荧光显微镜追踪并观察,移植后GFP+的白血病向骨髓腔侵袭的过程及其在骨髓腔中的定位。通过双光子预实验发现在经尾静脉移植白血病细胞的初期,白血病细胞并不像正常造血细胞一样归巢进入骨髓腔,而是显示在脾脏中有较多的GFP细胞存在,提示脾脏可能促进了白血病的病发过程。通过摘除脾实验来研究脾脏对于过表达Notch-1诱导的T-ALL白血病发展的影响。实验结果：成功构建了非照射小鼠T-ALL模型,经检测移植106、105、104白血病细胞的发病率为100%,移植103白血病细胞可以引起部分小鼠发病,移植102白血病细胞不会诱发白血病。移植白血病细胞后,随着白血病的发展,血液成分中的WBC(White blood cells)数量明显增加(t=3.392,P<0.01),而Plts(Platelets)的数量却明显减少,RBC(Red blood cells)的数量则没有明显变化。动力学实验研究表明,和对照组相比,白血病环境中HPC的数量随着白血病进程的发展呈现出先增高后下降的变化趋势[GMP (LSK-CD34+CD16/32+)、CMP (LSK-CD34+CD16/32-)]无显著性变化,MEP[(LSK-CD34-CD16/32-)]在发病后期有所下降；HSC在白血病环境中残留的正常造血细胞中的比例以及数量相对于对照组而言,MPP(LSK+CD34+Flk2+)、 ST-HSC(LSK+CD34+Flk2-)、 LT-HSC(LSK+CD34-Flk2-或LSK+SLAM+)随着白血病进程的发展,它们的相对比例显著高于对照组,绝对数量也有所增加。同时,HSC由静止期进入周期的比例显著增加。通过对白血病环境中造血细胞功能的研究,我们发现与对照组相比,白血病发病中末期的正常造血细胞的集落形成单位(colony forming unit, CFU)形成能力显著增强,CFU-GM (clone forming unit-Granulocyte/Macrophage)(13±1.22vs3±0.35CFCs/104骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclear cells, BMNCs),分别代表白血病组与对照组),CFU-mix (clone forming unit-mix)(8±1.13vs3±1.41CFCs/104BMNCs,分别代表白血病组与对照组)。同样竞争移植结果表明,白血病病发后中末期时,骨髓内的正常造血细胞相对于对照组有较强的竞争性与较高的植入率。由此说明白血病微环境对于正常造血细胞产生了很大的影响,为了能够更好的了解这一过程,我们通过基因芯片与蛋白芯片的方法来,来研究白血病细胞对机体以及骨髓腔环境所造成的影响,以及对HSC基因表达的影响。实验发现随着白血病的病程发展,正常LSK+细胞的基因变化数目及变化程度逐渐增强,在白血病病发过程中有9个基因是始终高表达,并用Real-timePCR对其进行了进一步的验证。骨髓与血清中共同高表达的细胞因子有3个,骨髓与血清中共同低表达的细胞因子有21个。在研究白血病微环境对正常造血细胞影响的同时,我们利用双光子显微镜技术观察白血病细胞在移植受体小鼠后,GFP细胞在骨髓腔内的迁移、定位情况,来研究白血病细胞致病的过程。对于正常细胞的归巢过程是HSC首先归巢到骨干区域的骨内膜处,然后移行到股骨头短的骨小梁区域的骨内膜下。白血病细胞移植后在各个脏器中都有累积,随着白血病的发展骨髓与脾脏中白血病细胞剧增,提示骨髓和脾脏在此模型中均起重要作用。通过尾静脉移植白血病细胞前和后进行脾脏切除手术,观察白血病发展规律,发现摘除脾脏能延缓白血病的发展,尤其在移植后摘除效果更好,提示脾脏在白血病细胞致病过程中起到促进与协助的作用。结论：1、首次成功构建成功构建了过表达Notch-1诱导的非照射小鼠T-ALL模型。2、在非照射模型的基础上,通过研究白血病微环境中的正常造血相关细胞的动力学以及功能实验,发现随着白血病的病程发展白血病环境中的造血干细胞虽然受抑但脱离白血病环境后重建造血能力增强。3、随着白血病的发展,LSK细胞表达的差异基因逐渐增多,其中Fosb、Egr1、Klf6、Fos、Nfkbiz、Cxc110、Rgs1等9个基因的高表达贯穿始终；白血病的发展还引起机体以及骨髓腔环境众多细胞因子水平发生变化。4、白血病细胞移植后在各个脏器中都有累积,随着白血病的发展骨髓与脾脏中白血病细胞剧增,提示骨髓和脾脏在此模型中均起重要作甩,脾脏摘除实验显示,脾脏对白血病细胞移植后导致白血病的发生有较强的辅助作用,脾脏的摘除能够明显延缓白血病的进程。