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猪圆环病毒(Porcinecircovirus,PCV)于1974年首次在猪肾细胞系中被发现,是迄今所知基因组最小、无囊膜、共价闭合、单链负股的DNA病毒。猪圆环病毒病(Porcinecircovirus-associated disease,PCVAD)成为目前严重危害世界养猪业的重要病原之一,自二十世纪九十年代初期首次发现于加拿大以来,韩国、美国、日本、法国等国家相继报道该病的发生。PCV2除引起猪体发生原发感染甚至死亡之外,还侵害猪的免疫系统,导致免疫抑制,或者继发其它的细菌与病毒感染,使疫情加重,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2 ORF2基因所编码的Cap蛋白是PCV2囊膜的主要结构成分,是PCV2主要的结构蛋白和免疫原性蛋白。Cap蛋白可作为抗原诊断疾病,在基因工程疫苗的研究中是首选的抗原。本研究从河南11个地区的猪场采集了 26份病料,共分离到了 17株PCV2病毒株,其中两株的全基因序列为1768bp,其余的15株为1767bp。对其相互间的同源性与进化关系进行了分析,17株分离株核苷酸序列的同源性为94.9%～99.9%。与国内外分离到的其他PCV2基因组序列进行进化关系比较,核苷酸序列的同源性为94.9%～100%,大多数河南分离株之间的亲缘关系更为接近。猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies,PRV)基因组为线状双链DNA,由独特的长区段(Unique Long,UL)和短区序列(Unique Short,US)以及US两侧的末端重复序列(TR)与内部重复序列(IR)所组成。PRV基因组包含有至少70个基因,编码70～100种蛋白质,作为载体可以将外源基因插入到非必需基因区并实现高效表达,在细胞上增殖滴度高,毒价易于检测。gG基因是PRV的一种非必需基因,是目前发现的所有野毒株均表达的一类糖蛋白,具有很强的抗原性,通常用来鉴别诊断猪是感染野毒株还是接种了疫苗免疫株。猪白细胞介素18(Interleukin 18)是主要由活化的巨噬细胞产生的一种细胞因子,可以诱导大量INF-γ的分泌,促进T、B淋巴细胞的分化,增强NK细胞活性,增强FasL介导的细胞毒性作用,诱导产生IL-2和GM-CSF等,在抗微生物感染和肿瘤免疫治疗等方面具有广阔的应用前景。根据GenBank中已发表的PRVgG基因序列,设计并合成了一对特异性引物,采用PCR方法从PRV-FA病毒株基因组中扩增出包含PRVgG全基因、部分pK基因、部分gD基因的一段序列,长度为3.1 kb,并将其进行克隆和测序。将得到的3.1 kb片段的DNA质粒用SphⅠ和KpnⅠ消化酶切后,亚克隆到载体pUC19中,获得重组质粒PUP。以pcDNA3.1(+)载体为模板,设计引物,经PCR扩增得到约0.3kb的SV40Poly(A)片段,经BamHI和PstⅠ酶切后,将其克隆到重组质粒PUP的BaomHI和PstⅠ酶切位点上,构建重组质粒PUPS。将重组质粒PUPS上的HindⅢ酶切位点进行消除,得到改造完成的PUPS。将pEGFP-n1载体进行改造,消除掉其上的BamHI和PstⅠ酶切位点。根据改造过的pEGFP-n1载体基因序列设计一对引物,通过PCR扩增技术得到目的基因EGFP(包括GFP、CMV、MCS、SV40Poly(A)),将目的基因克隆入pMD18-T载体内。将改造后的PUPS用PstⅠ酶切后,再进行去磷酸化,与同样经PstⅠ酶切处理的EGFP进行连接,通过PCR扩增、酶切、序列测定,证实该转移载体构建成功,并将其命名为PG。用BglⅡ分别酶切含有IL-18基因的质粒pIRES-IL18和载体PG,回收,将载体PG去磷酸化后与目的片段IL-18基因连接,构建了重组质粒PG18。用BamH I分别酶切含有ORF2基因的质粒psy538-ORF2和载体PG质粒并回收,将载体PG去磷酸化后与目的片段ORF2基因连接,构建了重组质粒PGO;再将质粒pIRES-IL18和PGO同时进行BglⅡ酶切,将PGO与IL-18基因片段连接,构建了重组质粒PG018。通过PCR扩增、酶切、序列测定证明,三种转移载体构建成功,且插入方向正确。将PG018重组质粒与PRV弱毒疫苗株HB98提取的DNA经脂质体2000作用共转染ST细胞,进行同源重组,在荧光显微镜下观察PRV-gG-ORF2-IL18重组病毒能够发出大量绿色荧光。对重组病毒进行空斑纯化,通过3轮蚀斑筛选,对筛选的重组病毒分别进行PCR检测、Western-blotting检测、淋巴细胞增殖试验、细胞中的转录检测、IPMA检测和遗传稳定性分析,证实所得到的病毒为重组病毒。将纯化得到的重组病毒PRV-gG-ORF2-IL18与本实验室纯化得到的重组病毒PRV-gG-ORF2进行小鼠免疫试验,同时设PRV HB98疫苗株、PCV2商品化灭活苗和DMEM对照组。经PRV与PCV2抗体检测、MTT淋巴细胞增殖试验、T淋巴细胞亚群检测和攻毒保护实验,结果表明重组病毒能显著刺激小鼠产生抗体,刺激淋巴细胞增殖,T淋巴细胞亚群数增多,且对强毒攻击有很好的保护作用。以分离得到的ZZ-1(GenbankNO.KC753772)株为模板,构建psy538-ORF2重组质粒,以其编码PCV2核衣壳蛋白的ORF2基因和猪IL-18基因为研究对象,以伪狂犬病毒弱毒疫苗株HB98株为亲本毒,构建了表达PCV2-ORF2和IL-18基因的重组伪狂犬病毒,为生产上防治PCV2感染提供新的思路和理论依据。