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草菇在生长发育过程中会合成和分泌多种纤维素降解酶,以降解和利用棉籽壳、木屑、稻草等纤维素类培养料,但因为纤维素大分子不可能直接进入菌丝体内,因此菌丝合成的纤维素降解酶必须分泌到菌丝体外才能发挥作用.前期研究表明 V.volvacea可以产生三种纤维素酶即内切型纤维素酶即葡聚糖内切酶(EC3.2.1.4),外切型纤维素酶(EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)等多种成分.本实验选择了葡聚糖内切酶EG1作为研究对象,研究了碳源对草菇葡聚糖内切酶合成的诱导调控机理.
真菌纤维素酶是一种诱导酶,碳源同时也是主要的诱导物来源.实验中利用了western blotting技术检测了不同碳源诱导下EG1的分泌,结果发现草菇产纤维素酶的诱导源很宽,α-乳糖、纤维二糖、羧甲基纤维素、微晶纤维素、麸皮等均能诱导草菇产生EG1;在含有微晶纤维素的液体培养基中生长10天,EG1在草菇菌丝中有高效表达;在天然稻草为基质的固体栽培料生长时,草菇EG1的表达和草菇菌丝生长与出菇相对应,分别在菌丝生长期、分化期、菇体成熟期EG1的分泌量达到最大.
为了更深入的研究碳源对EG1的诱导表达,我们重点研究以α-乳糖、纤维二糖、山梨糖为碳源诱导草菇EG1的分泌,结果发现α-乳糖、纤维二糖均能诱导EG1的高效表达,而山梨糖却不能;又对不同浓度的α-乳糖和纤维二糖诱导24小时进行研究,结果发现在低浓度时也均能诱导EG1的表达,α-乳糖在浓度为0.5％诱导表达量最大,纤维二糖则是在浓度为2％诱导表达量最大;当两种糖共同作用时,山梨糖阻遏了α-乳糖对EG1的诱导,却对纤维二糖诱导影响不大;而当α-乳糖和纤维二糖共同作用时使EG1的表达滞后.
实验中利用RT-PCR技术研究了草菇中葡聚糖内切酶基因eg1在α-乳糖诱导下转录水平的表达,加入α-乳糖诱导3个小时后用RT-PCR方法检测eg1的诱导表达,在4.5小时表达信号最强,随后9小时表达减弱,24小时后表达变得非常弱.