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三唑类农药是农业生产中应用最广泛的一类杀菌剂，同时一部分三唑类杀菌剂还具有一定的植物生长调节作用。几乎所有的三唑类农药化学结构中都含有手性中心，具有一对或者多对对映异构体。手性三唑类杀菌剂对映体的毒性和活性存在差异，在动物体内的吸收、分布、代谢、排泄(ADME)过程中存在立体选择性。有研究表明手性三唑类杀菌剂可以造成动物的肾毒性，因此美国环境保护署（EPA）将其分级为“潜在人类致癌物”。然而，大部分该类手性农药目前仍以外消旋体形式生产和销售，这有可能对环境及人类健康具有潜在的危害。
本文选择了戊唑醇、灭菌唑、己唑醇、戊菌唑、烯效唑共五种典型手性三唑类杀菌剂作为研究对象，利用药物转运体的转基因细胞系评价了上述三唑类与肾脏药物转运体，如OAT1、OAT3、OCT2、OCTN1、OCTN2、MRP2、MDR1、BCRP、MATE1、MATE2-K的相互作用。在此基础上，研究了灭菌唑与OAT1相互作用的立体选择性，包括OAT1底物和抑制剂的确证、转运的立体选择性、大鼠体内过程的立体选择性（大鼠药代动力学、组织分布、血浆蛋白结合、尿液排泄）。
主要结果如下：
1、开发和验证三唑类的LC-MS/MS分析方法
为研究三唑类手性农药与肾脏转运体的相互作用，建立了戊唑醇、灭菌唑、己唑醇、戊菌唑和烯效唑在细胞裂解液中的LC-MS/MS分析方法;为研究灭菌唑对映体立体选择性ADME作用，建立了灭菌唑对映体在大鼠血浆、组织、粪便、尿液和PBS缓冲盐中的手性LC-MS/MS分析方法。分析方法学验证实验结果表明，建立的分析方法专属性、线性范围、灵敏度、精密度、准确度、提取回收率、基质效应、样品稳定性等满足生物样品中药物分析相关指南的要求。
2、五种三唑类手性农药与肾脏转运体的相互作用
采用实验室已经构建高表达人药物转运体的细胞模型考察了五种三唑类化合物与肾脏中表达量较高的转运体的相互作用。灭菌唑是OAT1和OAT3的底物，戊菌唑是OCT2的抑制剂。戊唑醇、己唑醇和戊菌唑是MATE2-K的抑制剂，抑制强度顺序为：戊唑醇＞己唑醇＞戊菌唑。戊唑醇、灭菌唑、己唑醇、戊菌唑、烯效唑为MATE1转运体的抑制剂，抑制强度顺序为：戊菌唑＞烯效唑＞己唑醇＞戊唑醇＞灭菌唑。
3、灭菌唑对映体的大鼠药代动力学
采用制备液相色谱法分离获得了R-(-)-灭菌唑和S-(+)-灭菌唑，光学纯度均为98%。应用手性LC-MS/MS方法研究了灭菌唑对映体在大鼠的血浆药代动力学行为。50mg/kg灭菌唑消旋体给药后，R-(-)-灭菌唑和S-(+)-灭菌唑的AUC(0-∞)分别为2409±40.90mg/L*h和686.0±26.70mg/L*h，R-(-)-灭菌唑的AUC(0-∞)是S-(+)-灭菌唑的3.5倍；R-(-)-灭菌唑和S-(+)-灭菌唑的Cmax分别为683.0±57.00mg/L和191.0±47.20mg/L，R-(-)-灭菌唑的Cmax是S-(+)-灭菌唑的3.6倍。上述结果均表明灭菌唑的大鼠血浆药代动力学行为存在立体选择性差异，即相同给药剂量的R-(-)-灭菌唑较S-(+)-灭菌唑有更大的血浆暴露量和Cmax。
4、灭菌唑对映体的大鼠组织分布
大鼠灌胃给予50mg/kg灭菌唑后，灭菌唑在组织中分布广泛。肾脏、肝脏、胃和小肠为四个主要的分布器官，其次是大脑、肺和肌肉。肾脏OAT1转运蛋白的表达量较高，灭菌唑是OAT1的底物，可以通过OAT1的主动转运进入肾脏，且OAT1优先转运S-(+)-灭菌唑，使其在肾脏中含量较S-(+)-灭菌唑高，呈现立体选择性分布。
5、灭菌唑大鼠血浆蛋白结合率
采用体外平衡透析法，应用LC-MS/MS方法分别测定PBS和大鼠血浆中的灭菌唑对映体含量，考察了R-(-)-灭菌唑、S-(+)-灭菌唑与大鼠的体外血浆蛋白结合率。灭菌唑在血浆中孵育的浓度为1、5、12.5、25、50和100μg/mL，相当于R-(-)-灭菌唑、S-(+)-灭菌唑的浓度为0.5、2.5、6.25、12.5、25和50μg/mL，其与大鼠血浆蛋白结合率分别为98.0%~99.3%、97.0%~99.5%。上述结果表明，灭菌唑与血浆蛋白具有非常高的结合率，而且两对映体之间未见明显的立体选择性差异。
6、灭菌唑大鼠排泄
SD大鼠单次灌胃50mg/kg灭菌唑，连续收集24h尿液，研究发现，尿液中灭菌唑含量占给药量的64.00%，表明进入动物体内的灭菌唑主要经过肾脏通过尿液排出体外。实验结果显示，S-(+)-灭菌唑的排泄率（37.58±0.11%）大于R-(-)-灭菌唑（26.43±0.08%），表明灭菌唑肾脏排泄存在立体选择性，其机理可能是肾脏OAT1优先摄取S-(+)-灭菌唑。同样给药剂量，连续收集SD大鼠72h粪便，粪便中灭菌唑总含量占给药量的13.70%。实验结果显示S-(+)-灭菌唑的排泄率与R-(-)-灭菌唑基本相同，说明灭菌唑经粪便排出时不存在立体选择性。
7、OAT1抑制剂吲哚美辛对灭菌唑对映体大鼠药动学和肾脏组织分布影响
灭菌唑对映体与OAT1作用有立体选择性，时间依赖和浓度依赖实验表明，OAT1优先转运S-(+)-灭菌唑。SD大鼠联合给予OATs的强抑制剂吲哚美辛和灭菌唑后，吲哚美辛可以显著增加灭菌唑对映体的血药浓度，R-(-)-灭菌唑的AUC(0-t)和AUC(0-∞)分别增加了56.00%和55.00%，而清除率降低。并且吲哚美辛可减小灭菌唑对映体在大鼠肾脏分布的立体选择性差异。
本文选择了戊唑醇、灭菌唑、己唑醇、戊菌唑、烯效唑共五种典型手性三唑类杀菌剂作为研究对象，利用药物转运体的转基因细胞系评价了上述三唑类与肾脏药物转运体，如OAT1、OAT3、OCT2、OCTN1、OCTN2、MRP2、MDR1、BCRP、MATE1、MATE2-K的相互作用。在此基础上，研究了灭菌唑与OAT1相互作用的立体选择性，包括OAT1底物和抑制剂的确证、转运的立体选择性、大鼠体内过程的立体选择性（大鼠药代动力学、组织分布、血浆蛋白结合、尿液排泄）。
主要结果如下：
1、开发和验证三唑类的LC-MS/MS分析方法
为研究三唑类手性农药与肾脏转运体的相互作用，建立了戊唑醇、灭菌唑、己唑醇、戊菌唑和烯效唑在细胞裂解液中的LC-MS/MS分析方法;为研究灭菌唑对映体立体选择性ADME作用，建立了灭菌唑对映体在大鼠血浆、组织、粪便、尿液和PBS缓冲盐中的手性LC-MS/MS分析方法。分析方法学验证实验结果表明，建立的分析方法专属性、线性范围、灵敏度、精密度、准确度、提取回收率、基质效应、样品稳定性等满足生物样品中药物分析相关指南的要求。
2、五种三唑类手性农药与肾脏转运体的相互作用
采用实验室已经构建高表达人药物转运体的细胞模型考察了五种三唑类化合物与肾脏中表达量较高的转运体的相互作用。灭菌唑是OAT1和OAT3的底物，戊菌唑是OCT2的抑制剂。戊唑醇、己唑醇和戊菌唑是MATE2-K的抑制剂，抑制强度顺序为：戊唑醇＞己唑醇＞戊菌唑。戊唑醇、灭菌唑、己唑醇、戊菌唑、烯效唑为MATE1转运体的抑制剂，抑制强度顺序为：戊菌唑＞烯效唑＞己唑醇＞戊唑醇＞灭菌唑。
3、灭菌唑对映体的大鼠药代动力学
采用制备液相色谱法分离获得了R-(-)-灭菌唑和S-(+)-灭菌唑，光学纯度均为98%。应用手性LC-MS/MS方法研究了灭菌唑对映体在大鼠的血浆药代动力学行为。50mg/kg灭菌唑消旋体给药后，R-(-)-灭菌唑和S-(+)-灭菌唑的AUC(0-∞)分别为2409±40.90mg/L*h和686.0±26.70mg/L*h，R-(-)-灭菌唑的AUC(0-∞)是S-(+)-灭菌唑的3.5倍；R-(-)-灭菌唑和S-(+)-灭菌唑的Cmax分别为683.0±57.00mg/L和191.0±47.20mg/L，R-(-)-灭菌唑的Cmax是S-(+)-灭菌唑的3.6倍。上述结果均表明灭菌唑的大鼠血浆药代动力学行为存在立体选择性差异，即相同给药剂量的R-(-)-灭菌唑较S-(+)-灭菌唑有更大的血浆暴露量和Cmax。
4、灭菌唑对映体的大鼠组织分布
大鼠灌胃给予50mg/kg灭菌唑后，灭菌唑在组织中分布广泛。肾脏、肝脏、胃和小肠为四个主要的分布器官，其次是大脑、肺和肌肉。肾脏OAT1转运蛋白的表达量较高，灭菌唑是OAT1的底物，可以通过OAT1的主动转运进入肾脏，且OAT1优先转运S-(+)-灭菌唑，使其在肾脏中含量较S-(+)-灭菌唑高，呈现立体选择性分布。
5、灭菌唑大鼠血浆蛋白结合率
采用体外平衡透析法，应用LC-MS/MS方法分别测定PBS和大鼠血浆中的灭菌唑对映体含量，考察了R-(-)-灭菌唑、S-(+)-灭菌唑与大鼠的体外血浆蛋白结合率。灭菌唑在血浆中孵育的浓度为1、5、12.5、25、50和100μg/mL，相当于R-(-)-灭菌唑、S-(+)-灭菌唑的浓度为0.5、2.5、6.25、12.5、25和50μg/mL，其与大鼠血浆蛋白结合率分别为98.0%~99.3%、97.0%~99.5%。上述结果表明，灭菌唑与血浆蛋白具有非常高的结合率，而且两对映体之间未见明显的立体选择性差异。
6、灭菌唑大鼠排泄
SD大鼠单次灌胃50mg/kg灭菌唑，连续收集24h尿液，研究发现，尿液中灭菌唑含量占给药量的64.00%，表明进入动物体内的灭菌唑主要经过肾脏通过尿液排出体外。实验结果显示，S-(+)-灭菌唑的排泄率（37.58±0.11%）大于R-(-)-灭菌唑（26.43±0.08%），表明灭菌唑肾脏排泄存在立体选择性，其机理可能是肾脏OAT1优先摄取S-(+)-灭菌唑。同样给药剂量，连续收集SD大鼠72h粪便，粪便中灭菌唑总含量占给药量的13.70%。实验结果显示S-(+)-灭菌唑的排泄率与R-(-)-灭菌唑基本相同，说明灭菌唑经粪便排出时不存在立体选择性。
7、OAT1抑制剂吲哚美辛对灭菌唑对映体大鼠药动学和肾脏组织分布影响
灭菌唑对映体与OAT1作用有立体选择性，时间依赖和浓度依赖实验表明，OAT1优先转运S-(+)-灭菌唑。SD大鼠联合给予OATs的强抑制剂吲哚美辛和灭菌唑后，吲哚美辛可以显著增加灭菌唑对映体的血药浓度，R-(-)-灭菌唑的AUC(0-t)和AUC(0-∞)分别增加了56.00%和55.00%，而清除率降低。并且吲哚美辛可减小灭菌唑对映体在大鼠肾脏分布的立体选择性差异。