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研究背景及目的:在最新发布的全球癌症统计报告中显示,宫颈癌的新增病人数和死亡数都增长迅速,严重威胁着全世界女性的生命健康。在目前女性肿瘤中,宫颈癌是第二大恶性肿瘤,其发病率和死亡率仅低于乳腺癌,而且宫颈癌有年轻化发展的趋势,它的主要致病因素为人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）的感染。在晚期宫颈癌的治疗中面临着难以治愈、容易复发等问题,这些都与宫颈癌细胞的高度增殖能力相关。因此急需寻找到有效抑制宫颈癌细胞增殖的蛋白靶点和相关机制。三结构域蛋白21（Tripartite motif 21,TRIM21）是一类在细胞内发挥着重要生物学作用、具有高度保守结构域蛋白家族中的一员。TRIM21作为一种胞浆抗体Fc受体,在细胞发生病原体（如病毒、细菌）感染时可以发挥强有力的抗病原体作用,同时TRIM21也具有调节细胞自噬的功能。最新的研究证明,TRIM21的表达水平与恶性肿瘤的发生发展有着密切的联系,尤其对肿瘤细胞的增殖调控发挥着重要的作用,但其与宫颈癌的关系尚不清楚。因此,探讨TRIM21蛋白调控宫颈癌细胞自噬和增殖的相关作用和机制,将有益于宫颈癌在临床上的治疗。本研究的目的在于探讨TRIM21对宫颈癌细胞自噬和增殖的调控作用及其分子机制,从而为以其为靶标的临床治疗提供依据。研究内容及研究方法:第一部分TRIM21抑制宫颈癌细胞的自噬1.Western blot检测TRIM21和自噬标志蛋白在HPV阳性和HPV阴性宫颈癌细胞系中的表达水平2.过表达或沉默TRIM21后,观察TRIM21水平变化对宫颈癌细胞自噬水平的抑制作用。第二部分TRIM21抑制宫颈癌细胞的增殖1.CCK-8法检测TRIM21对宫颈癌细胞存活的作用。2.流式细胞术检测TRIM21对宫颈癌细胞凋亡的影响。3.细胞克隆形成实验检测TRIM21对宫颈癌细胞增殖的作用。4.流式细胞术检测TRIM21对宫颈癌细胞周期的影响。第三部分TRIM21/ATG4B复合体介导了宫颈癌细胞的增殖抑制1.TCGA数据库分析宫颈癌中TRIM21和ATG4B表达水平的相关性。2.Western blot检测宫颈癌细胞中TRIM21对ATG4B表达的影响。3.实时定量PCR分析TRIM21对ATG4B转录水平的影响,免疫共沉淀实验分析TRIM21与ATG4B之间的相互作用。4.确定TRIM21对宫颈癌细胞增殖的抑制作用是否依赖对ATG4B及自噬的抑制。根据以上实验的内容,主要应用到的研究方法有:1.宫颈癌细胞系HeLa细胞和C33A细胞的体外培养和传代。2.Western blot检测各种细胞系中蛋白的表达水平。3.流式细胞术检测各种细胞的自噬、凋亡和周期变化情况。4.CCK-8法检测各细胞系的细胞存活情况。5.瞬时转染技术改变细胞目的蛋白的表达量。6.细胞克隆实验检测单细胞的增殖能力。7.运用TCGA数据库分析TRIM21和ATG4B的相关性。8.Real-time PCR检测细胞中mRNA的表达水平。9.免疫共沉淀技术检测TRIM21/ATG4B复合体。结果:1.HPV阳性宫颈癌细胞的TRIM21表达水平高于HPV阴性宫颈癌细胞,而自噬水平低于HPV阴性宫颈癌细胞。2.TRIM21的过表达可以抑制宫颈癌细胞的自噬、存活和增殖,而沉默TRIM21可以增强癌细胞的自噬、存活和增殖。3.TRIM21对宫颈癌细胞的凋亡无明显作用。4.TRIM21将宫颈癌细胞的周期阻滞于G0/G1期。5.TRIM21在宫颈癌细胞中下调了ATG4B表达并抑制自噬。6.TRIM21下调ATG4B是通过形成TRIM21/ATG4B复合体的方式,而非抑制其转录水平。7.TRIM21通过下调ATG4B从而抑制宫颈癌细胞的增殖。结论:TRIM21可以抑制宫颈癌细胞的存活。TRIM21和ATG4B以形成了复合体的方式下调了ATG4B表达和抑制了细胞自噬。TRIM21通过阻断ATG4B介导的细胞周期加速和ATG4B介导的自噬从而抑制了宫颈癌细胞的增殖。这些结果可能为以TRIM21为靶点的宫颈癌治疗新策略的发展铺平道路。