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目的本实验以纯化的中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)作为抗原,免疫BALB/c小鼠,制备抗CSBV单克隆抗体,并对其效价、特异性和病毒中和能力进行检测。在此基础上,用制备的抗CSBV单克隆抗体作为诊断抗体,建立一种检测CSBV的琼脂扩散检测方法。方法本实验利用纯化的CSBV作为抗原免疫Balb/c小鼠,经过3次免疫后,小鼠断尾采血测其血清效价,选择效价较高的小鼠,在细胞融合前3~4 d再加强免疫一次。取免疫小鼠脾淋巴细胞通过杂交瘤技术与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株并通过有限稀释的方法进行3次亚克隆后,制备腹水型单克隆抗体。获得能稳定分泌抗CSBV的单克隆抗体,利用间接ELISA方法检测抗体效价及其特异性。将以纯化好的腹水单克隆抗体分别与CSBV互作后,接种于2~3日龄中华蜜蜂幼虫,通过观察幼虫死亡率鉴定抗体的中和作用。在此基础上,以制备的抗CSBV单克隆抗体作为诊断抗体,,通过对琼脂板配置条件、琼脂扩散的观察时间、CSBV的最佳稀释浓度和抗CSBV单克隆抗体的稀释度进行优化,建立一种用于检测CSBV的琼脂扩散检测方法,并对其特异性、敏感性和稳定性进行验证。结果通过杂交瘤技术并经3次亚克隆后获得10株阳性杂交瘤细胞,分别标记为10C3、10A1、10C4、9A5、11D7、5B10、5A5、5H2、1D3和3C10。并将其注入小鼠腹腔制备腹水,得到了9株稳定分泌抗CSBV的腹水型单克隆抗体,分别为10A1、10C4、9A5、11D7、5B10、5A5、5H2、1D3和3C10。利用间接ELISA实验检测其效价都在1﹕16000以上。在此基础上,对抗CSBV单克隆抗体的亚型、稳定性和特异性进行鉴定,单克隆抗体的亚型结果显示单克隆抗体5A5、1D3和3C10是IgG1亚型;10A1和5B10是IgG2a;9A5和10C4是IgG2b亚型;11D7和5H2是IgM亚型;稳定性实验结果表明,单克隆抗体9A5和5A5的上清液所分泌的抗体效价没有变化,3C10、5H2和10A1在第10代的时候分泌抗体的能力降低,但2代之后到10代之间抗体分泌比较稳定,说明这5株杂交瘤细胞均能比较稳定的分泌抗体;特异性实验结果表明,9株单克隆抗体只与CSBV反应,与CBPV、DWV和BQCV均不反应。将以纯化好的9株腹水单克隆抗体分别与CSBV互作后,接种于2~3日龄中华蜜蜂幼虫,其中5A5、10A1和9A5株单克隆抗体具有中和CSBV的能力。在此基础上,以抗CSBV单克隆抗体作为诊断抗体建立一种用于检测CSBV的琼脂扩散检测方,通过对琼脂扩散检测条件和观察时间优化,确定抗体最佳稀释度为1﹕4000、CSBV最佳稀释度是1﹕2和琼脂扩散检测最佳观察时间为48h,通过对该检测方法的稳定性、特异性和敏感性验证,结果表明CSBV与抗CSBV单克隆抗体之间存在良好的交叉免疫原反应。琼脂扩散检测方法具有操作简便、快捷和适用于基层应用的优势,为CSBV的防治研究奠定了基础。结论1、成功的制备了3株具有病毒中和能力的抗CSBV单克隆抗体5A5、10A1和9A5,为CSBV的防治和检测提供了物质储备。2、以抗CSBV单克隆抗体为诊断抗体,建立了建立一种用于检测CSBV的琼脂扩散检测方法,该检测方法具有特异、稳定、操作简便和快捷等特点。