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目的:慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种慢性气道炎症性疾病，以气流受限、反复咳嗽、咳痰、气促和呼吸困难为主要特征，且其气流受限不完全可逆并呈进行性发展，其发病过程中活化的炎症细胞释放多种介质，是由于感染、免疫、中毒等因素引起肺部和各级支气管内炎性细胞的浸润，包括巨噬细胞和中性粒细胞等，这些炎性细胞均能够释放炎症介质导致瀑布级联，从而促使肺部炎性介质和抗炎介质失衡引发肺部疾病。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）能够刺激机体中性粒细胞、巨噬细胞等释放大量炎性介质，从而促进COPD等炎症性肺病（inflammatory lung disease，ILD）的发生。肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages，AMs）是LPS引起COPD等ILD发生主要效应细胞，是肺第一道防线，它能够释放多种炎症因子从而使炎性介质、抗炎介质失衡诱发肺部炎症。抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号转导通路可以减少促炎因子的释放。参与其中的这些细胞因子可能成为COPD治疗的新靶点。在本实验中我们以小鼠肺泡巨噬细胞株(MH-S)为研究对象，观察COPD患者血清与p38MAPK抑制剂SB203580对LPS诱导上述细胞分泌RANTES和IL-10的影响，并进一步探讨RANTES的表达，为将p38MAPK抑制剂应用于临床治疗COPD提供了新的理论基础。
方法:1、用ELISA法检测细胞上清液中RANTES浓度。常规培养MH-S细胞株，调整细胞浓度至5×106/ml，将细胞置于24孔板中培养并过夜，随机分组:①对照组:分别以1％、5％、10％健康人及COPD患者血清+RPMI1640及10％小牛血清+RPMI1640作为培养液孵育MH-S细胞;②LPS组:分别以1％、5％、10％健康人及COPD患者血清+RPMI1640及10％小牛血清+RPMI1640作为培养液孵育MH-S细胞6h后，应用LPS刺激，调整终浓度为100ng/ml;③LPS+SB组:分别以1％、5％、10％健康人及COPD患者血清+RPMI1640及10％小牛血清+RPMI1640作为培养液孵育MH-S细胞6h后，加入SB203580和LPS进行刺激，调整SB203580和LPS的终浓度分别为10μmol/L和100ng/ml，并使SB203580提前孵育20min后再加入LPS刺激。各组分别刺激6h，收集细胞上清液，冻存于-80℃冰箱，待ELISA法检测RANTES浓度。
2、用ELISA法检测细胞上清液中的IL-10浓度，方法和分组与RANTES测定相同。
3、免疫细胞化学法测定RANTES的表达变化。调整细胞浓度1×106/ml，于24孔板爬片过夜，仍按以上分组对MH-S细胞刺激后，用免疫细胞化学法检测各组细胞中RANTES的表达变化。
结果:1、细胞上清液中的RANTES含量变化:①LPS刺激MH-S细胞，细胞上清液中RANTES含量增加，且随血清浓度增高而增加，且用COPD患者血清孵育的细胞上清液中RANTES含量高于健康人。与相同类型血清同一浓度对照组相比较其差异具有统计学意义(P＜0.05)。用p38MAPK抑制剂SB203580+LPS干预后，RANTES含量减少，但仍高于对照组，与相同类型血清同一浓度对照组相比较其差异具有统计学意义(P＜0.05)。相同类型血清同一浓度LPS组与LPS+SB203580组比较(P＜0.05)也有统计学意义。②随着COPD患者血清浓度增高，RANTES含量在control组、LPS组和LPS+SB组均呈高度正相关(r=0.966,P＜0.01;r=0.974，P＜0.01;r=0.945，P＜0.01);随着健康人血清浓度增高，RANTES含量在control组、LPS组和LPS+SB组亦呈高度正相关(r=0.968，P＜0.01;r=0.979，P＜0.01;r=0.965，P＜0.01)。③COPD患者血清和LPS共同作用MH-S细胞可发挥协同作用，进一步诱导RANTES增加，与同一血清浓度健康对照组相比较(P＜0.05)差异有统计学意义。
2、细胞上清液中的IL-10含量变化:①LPS刺激MH-S细胞，细胞上清液中IL-10含量增加，且随血清浓度增高而增加，但用COPD患者血清孵育的细胞上清液中IL-10含量低于健康人。与相同类型血清同一浓度对照组相比较（P＜0.05）其差异具有统计学意义。用p38MAPK抑制剂SB203580+LPS干预后，IL-10含量减少，但仍高于对照组。与相同类型血清同一浓度对照组相比较其差异有统计学意义（P＜0.05）。相同类型血清同一浓度LPS组与LPS+SB203580组比较（P＜0.05）也有统计学意义。②随着COPD患者血清浓度增高，IL-10含量在control组、LPS组和LPS+SB组均呈显著正相关(r=0.920，P＜0.01;r=0.923，P＜0.01;r=0.765，P＜0.01);随着健康人血清浓度增高，IL-10含量在control组、LPS组和LPS+SB组亦呈高度正相关(r=0.983,P＜0.01;r=0.878，P＜0.01;r=0.985，P＜0.01)。③COPD患者血清与LPS对诱导IL-10分泌协同作用不明显。
3、免疫细胞化学测定RANTES的表达:对照组细胞质仅有微弱黄染;LPS刺激细胞后胞浆黄染增强;用SB203580预处理后，LPS刺激引起的胞浆黄染减弱但仍强于对照组;随着血清浓度增高胞浆黄染增强且COPD患者较健康人及小牛血清者黄染显著，各组与对照组比较均有统计学意义(P＜0.05)。LPS组与LPS+SB203580组比较（P＜0.05）也有统计学意义。
结论:1、LPS可引起MH-S细胞上清液中的RANTES及IL-10分泌增加，用SB203580干预后，RANTES、IL-10分泌减少，但仍高于对照组，提示SB203580可能部分抑制RANTES及IL-10分泌。
2、同一COPD患者随着血清浓度的增加RANTES及IL-10含量均呈增高趋势，均具有相关性，且RANTES含量高于健康人，IL-10含量低于健康人。提示COPD患者血清本身对MH-S细胞可能就是一种炎性刺激，且其对于RANTES分泌与LPS有协同作用。
3、无活性RANTES存在于胞浆。LPS刺激MH-S细胞后，RANTES被激活变为有活性的RANTES，胞浆显著黄染。应用SB203580干预后，胞浆黄染减弱，提示SB203580可通过p38MAPK减少其表达。