本论文研究分为两部分,第一部分的研究对象是粘细菌质粒pMF1；第二部分的研究对象是大肠杆菌细胞形状相关的骨架蛋白。粘细菌具有独特的细胞周期和复杂的形态发生行为,在原核生物细胞信号调控和进化的研究中是重要的模式材料。同时,粘细菌可以产生多种结构独特,作用方式新颖的次级代谢产物,被认为是一个重要的药源微生物类群。虽然应用于粘细菌的噬菌体和转座因子在一定程度上方便了遗传操作,但是粘细菌有限的遗传操作技术还是在很大程度上限制了粘细菌的遗传研究和应用。前期工作中,本实验室与中国科学院植物生理生态研究所合作,在Myxococcus fulvus124B02中分离到环形质粒pMF1。确定了质粒的最小复制区,并基于该复制区建立了Myxococcus-E. coli穿梭载体pZJY41,这在很大程度上方便了粘细菌中的遗传操作。但是,该穿梭载体在中显示了极大地遗传不稳定性,在无选择压力下质粒很快的丢失。pZJY41的遗传不稳定性极大的限制了穿梭载体的应用。对于低拷贝质粒来说,质粒自主分配最重要的就是质粒自主分配系统,在质粒上称为par loci。质粒的par loci通常包含一个自我调节的操纵子,包括两个基因和一个或多个类着丝粒位点。第一个基因编码一个NTPase,它们在质粒或染色体分配中起作用,而第二个基因编码一个DNA结合蛋白,结合到操纵子上下游的类着丝粒的iterons序列上。这两个基因及其上下游的类着丝粒区域对质粒分配是不可缺少的。质粒自主分配系统分为三类。Ⅰ型分配系统par loci编码一个ATPase,它包含一个Walker-A型motif. H型和Ⅲ型分别编码一个类肌动蛋白(actin-like)和一个类微管蛋白(tubulin-like)。而1型分配系统又根据操纵子调节方式,ParB蛋白的特点以及顺式作用位点的不同分为Ia和Ib两个亚型。在本论文中主要研究了粘细菌质粒pMF1遗传稳定区域的筛选和遗传稳定机制研究。首先将pMF1的两个亚克隆上的pMF1质粒DNA片段分别克隆到粘球菌—大肠杆菌穿梭载体上,测定其稳定性。结果发现带有pSQ37上的pMF1片段的载体pZJY4116稳定性有所提高,但带有pSQ38上的pMF1片段的载体pZJY4117被剪切。随后把这两个亚克隆上的片段进行分段筛选pMF1遗传稳定区,得到两个遗传稳定性提高的载体pXS2和pXS3,而且pXS3的稳定性要更高一些。随后将预测的重组酶基因和pMF1的971—3680nt也分别克隆到pXS3上,但是发现它们的稳定性也没有提高。pXS2和pXS3含有的pMF1DNA共同部分都包含一个操纵子结构,操纵子的其中一个基因与质粒自主分配相关的ATPase编码基因ParA同源性很高,序列比对发现该基因具有质粒自主分配相关ATPase的保守结构域,说明这个操纵子可能是质粒的自主分配系统。我们对这个操纵子进行了进一步研究。将该操纵子的三个基因parC, par A和parB,连同其上下游的短重复序列或多包括下游的长重复序列区域分别克隆到载体pZJY41匕,得到pXS11和pXS12,发现这两个载体的稳定性较pZJY41有显著提高,但是pXS12包含的操纵子下游的长重复序列并没有对稳定性有影响。构建了三个基因分别缺失的载体,相对于pXS11,它们遗传稳定性都降低,说明这三个基因对质粒遗传稳定性保持都是必需的。利用足迹法研究了parC和parB与操纵子上游序列的结合情况,发现parB可以结合上游的短重复序列,但parC不结合,说明parB(?)艮可能是质粒自主分配系统的DNA结合蛋白组份。凝胶阻滞实验进一步确认了ParB与上下游短重复序列的特异性结合活性。另外对pMF1整个DNA序列进行搜索,发现除了该操纵子的上下游,在pMF1的其他位置也存在类似的短重复序列。凝胶阻滞实验结果显示ParB与这些序列也是结合的,说明ParB的结合位置不仅包括操纵子上下游,还分布在pMF1的其他位置。对于parC基因的功能,凝胶阻滞实验结果显示,ParC蛋白的存在能够提高ParB与上游重复序列的结合活性。定量PCR实验测定parCAB三个基因的转录调节功能,发现ParB对操纵子转录具有显著下调作用(下调200倍),而ParC对操纵子转录具有小幅度的下调作用(下调10倍)。从ParA合ParB蛋白的大小,ParB的调节功能上看,该自主分配系统属于Ib型分配系统。但是ParC作为质粒自主分配系统的第三个基因,对ParB的功能起到辅助增强作用,这在过去质粒自主分配系统没有报道过的。本论文的第二部分是有关大肠杆菌细胞形状相关骨架蛋白的研究。大肠杆菌细胞形状决定骨架蛋白包括MreB, MreC, MreD, PBP2, RodA和RodZ。这些蛋白与细胞多种生物功能都是相关的,包括杆状细胞形状的保持。蛋白的缺失会导致细胞失去杆状形状而成圆形。同时,这些蛋白还与细胞极性决定,染色体分离以及细胞膜相关的细胞器分布有关。荧光标签标记定位和免疫荧光定位研究都表明这些蛋白在细胞中是呈螺旋形分布的。另外,在细胞分裂之前,这些蛋白通常会形成单环或双环结构,位于杆状细胞的横轴方向上,并且经常位于细胞分裂相关蛋白FtsZ环一侧或两侧。这种环结构很可能与这些蛋白在细胞分裂之前的分离有关。细胞分裂蛋白有结果表明,细胞MreB环结构的形成是只依赖FtsZ环而不依赖其他细胞分离蛋白,而MreC, PBP2环结构形成与MreB类似,也是不依赖除z环之外的其他细胞分裂相关蛋白的；而RodA环除了依赖FtsZ环,也依赖FtsK蛋白,但不依赖FtsQ。然而,这些结果都是在温度敏感型菌株中得到的,它们是否依赖细胞分裂蛋白FtsK必须要在ftsK基因缺失菌株中证明。本论文通过研究这些骨架蛋白在ftsK缺失菌株和FtsK回补菌株中的定位,研究骨架蛋白环结构与FtsK的依赖关系,并进一步讨论了这些环结构与FtsK N端细胞分裂相关结构域的关系。本论文主要研究了E.coli (?)田胞形状决定骨架蛋白MreB, MreC, PBP2, RodA以及RodZ所形成的环结构与细胞分裂相关蛋白FtsK的依赖关系。首先对RodZ在细胞中的定位进行了研究。发现RodZ在E.coli野生型菌株中能够形成环结构,并且该环结构的形成不依赖与其他形状决定骨架蛋白。另外,RodZ环与MreB类似的是,其形成也是依赖与z环形成的。但两者的不同在于,MreB环的形成只依赖z环形成而不依赖其他细胞分裂相关蛋白,但RodZ不能在ftsAts菌株和zipAts菌株中形成环,说明RodZ环的形成依赖除FtsZ外的其他细胞分裂蛋白。已经发表的结果表明,这些细胞形状相关骨架蛋白环结构的形成可能与这些蛋白形成的螺旋结构在细胞分裂前的分配有关,并且己报道的结果表示MreB, MreC和PBP2环结构只依赖FtsZ环,但不依赖其他细胞分裂蛋白,而RodA环不仅依赖FtsZ环,还依赖随后进入细胞分裂复合物的FtsK。因此随后我们重点研究了这些细胞形状相关骨架蛋白环结构与FtsK蛋白的依赖关系。结果发现,RodA, PBP2, RodZ和MreC环的形成都是依赖FtsK蛋白存在的,而MreB环结构的形成不依赖FtsK蛋白。进一步的结果显示,FtsK蛋白N端结构域就足以使RodA, PBP2和RodZ环结构形成,更进一步暗示了这些蛋白环结构与细胞分裂过程的时间和空间联系。