血管性痴呆(Vascular dementia,VD)是指由于长期处于各种缺血性、出血性及脑缺血缺氧性损害等脑血管病危险因素下,最终导致的获得性智能障碍综合征,为老年期痴呆的常见类型之一。氧化应激是体内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生与清除失去平衡而导致的一系列氧化性损伤过程,现普遍认为氧化应激是VD发生发展的主要危险因素之一。永久性结扎双侧颈总动脉(2-vessel occlusion,2VO)的大鼠通过阻断双侧颈总动脉血流使其脑组织处于低灌注低氧状态,尤其容易使得海马、皮层等与认知功能有关的结构发生氧化应激,最终发生学习记忆能力的损害。线粒体作为体内ROS产生的主要来源,亦是ROS攻击的重要靶点,后者使得线粒体发生功能障碍,线粒体膜电位(Mitochondrial transmembrane potential,Δψm)降低,引起线粒体通透性转运孔(Mitochondrial permeability transition pore,MPTP)开放,引发细胞凋亡或自噬等改变。番茄红素(Lycopene)是类胡萝卜素家族中的一员,具有强有力的淬灭单个氧原子及清除过氧化自由基的能力。因此,清除受损的线粒体,降低细胞ROS水平,拮抗氧化应激很可能是干预治疗血管性痴呆的一种行之有效的手段。线粒体自噬(Mitophagy)是线粒体在低氧、饥饿等应激状态下,损伤的线粒体选择性的被自噬泡所吞噬降解的过程。在低氧环境中,适当的线粒体自噬可通过及时清除受损线粒体而对细胞起到保护作用,然而过度的线粒体自噬则可引发自噬性死亡等负性改变。NIX蛋白(Nip3-like protein X,NIX)主要位于线粒体外膜,当线粒体受到损害时,NIX表达上调,可与微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3)相结合,引起自噬体吞噬损伤线粒体并与溶酶体相融合,以此清除受损线粒体。LC3分为Ⅰ型和Ⅱ型,LC3-Ⅱ的表达或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值可反映细胞的自噬水平。低氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)是细胞针对低氧应答产生的一种转录因子,当机体处于低氧状态,氧化应激增强,ROS产生增多,最终可激活HIF-1α,后者又可激活NIX基因,NIX表达上调,引起NIX参与的自噬的产生,故HIF-1α既是2VO大鼠脑内低氧环境所诱导产生的,又是NIX表达上调的前提条件。目的观察番茄红素早期干预对2VO大鼠学习记忆能力及海马结构的影响;观察2VO大鼠及早期干预后海马结构NIX参与的线粒体自噬水平,从而探讨NIX参与的线粒体自噬在2VO大鼠海马结构中的可能作用。方法(1)大鼠随机分组后,各剂量组大鼠术后7天立即给予不同剂量的番茄红素水溶液,假手术组及模型组大鼠给予双蒸水,隔天灌胃给药一次,持续1月。(2)以Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力,HE染色观察比较各组大鼠海马结构各区域组织形态学改变。(3)脑片荧光染色法、共聚焦激光扫描显微镜技术观测各组大鼠海马结构ROS改变。(4)Tunel法、共聚焦激光扫描显微镜技术检测各组大鼠海马结构细胞凋亡率。(5)Western blot检测海马结构LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值。(6)荧光免疫组化法、共聚焦激光扫描显微镜技术观察各组大鼠海马结构NIX、LC3B、HIF-1α的荧光强度,运用体视学计算NIX-LC3B-Mito Tracker Green共定位数和HIF-1α-DAPI共定位数。结果(1)各组大鼠在术前平均逃避潜伏期及术后运动速度没有明显差别的基础上,模型组大鼠的平均逃避潜伏期较假手术组大鼠增高(P<0.05),模型组大鼠的趋向式和直线式的总比例较假手术组大鼠减少(P<0.05),低剂量组大鼠平均逃避潜伏期较模型组大鼠明显缩短(P<0.05),模型组与低剂量组大鼠趋向式和直线式的总比例有明显差别(P<0.05),且三个药物剂量组中,以低剂量组大鼠逃避潜伏期最短,趋向式和直线式的总比例最高(P<0.05)。(2)假手术组大鼠海马结构锥体细胞及颗粒细胞层次分明,排列紧密,细胞结构完整,细胞核大而清晰,呈圆形。模型组大鼠细胞层次不清,排列紊乱,胞体收缩,胞质深染,呈不规则形,细胞周围间隙增大,呈空泡样变,细胞核深染不可见。低剂量组大鼠海马结构锥体细胞及颗粒细胞改变类似假手术组,中、高剂量组大鼠海马结构锥体细胞及颗粒细胞都存在一定程度的病理改变。(3)各组大鼠海马结构CA1、CA3、DG区及三区总量的ROS荧光强度存在组间差异(P<0.01),其中模型组大鼠海马结构CA1、CA3、DG及三区总量ROS荧光强度较假手术组和低剂量组显著增加(P<0.01),三个药物剂量组中,以低剂量组大鼠海马结构CA1、CA3、DG三区的总量ROS荧光强度显著低于中剂量组(P<0.01)和高剂量组(P<0.01)。(4)各组大鼠海马结构CA3及CA1、CA3、DG三区的总量细胞凋亡率存在组间差异(P<0.05),CA1、DG区细胞凋亡率组间差异没有统计学意义(P>0.05)。观察统计学有意义的区域细胞凋亡率的趋势,假手术组大鼠海马结构细胞凋亡率低于模型组,三个药物剂量组中,以低剂量组细胞凋亡率最低,且低剂量组细胞凋亡率亦低于假手术组。(5)LC3BⅡHMP/LC3BⅠ(HMP+HCP)在各组大鼠海马结构细胞中存在组间差异(P<0.05),LC3BⅡHTP/LC3BⅠHTP在各组大鼠海马结构细胞中组间没有差别(P>0.05)。观察其趋势,模型组大鼠海马结构细胞线粒体上的LC3BⅡ的表达较假手术组高,三个药物剂量中以中剂量组LC3BⅡ的表达最高,其次是低剂量组和高剂量组。(6)各组大鼠海马结构CA1、CA3和DG区及三区总量NIX平均荧光强度值组间差异有显著的统计学意义(P<0.01)。模型组大鼠海马结构CA1、CA3、DG区及三区的总量NIX的表达均高于假手术组(P<0.01)和低剂量组(P<0.01)。LC3B平均荧光强度值DG区组间差异没有统计学意义(P>0.05),CA1、CA3区及三区总量组间差异有显著的统计学意义(P<0.01)。其中,模型组大鼠海马结构CA1区LC3B的表达高于假手术组(P<0.01)和低剂量组(P<0.01)。各组大鼠CA1、CA3、DG区及三区总量NIX-C3B-Mito Tracker Green共定位数目均存在组间差异(P<0.01)。其中,模型组大鼠海马结构CA3区共定位数目较假手术组多(P<0.05),CA1及CA3区共定位数目较低剂量组多(P<0.05)。(7)各组大鼠海马结构CA1、CA3区及三区总量HIF-1α的表达均存在组间差异(P<0.05),DG区HIF-1α的表达组间差异无统计学意义(P>0.05)。其中,模型组海马结构HIF-1α的表达较假手术组高,三个药物剂量组中,中、高剂量组海马结构HIF-1α的表达均较低剂量组高。各组大鼠CA1、CA3、DG区及三区总量HIF-1α-DAPI共定位数目均存在组间差异(P<0.05)。其中,模型组大鼠海马结构CA1、DG区共定位数目较假手术组高(P<0.05),三个药物剂量组中,以低剂量组大鼠海马结构CA1、DG区及三区总量共定位数目最低(P<0.05)。(8)NIX-LC3B-Mito Tracker Green与HIF-1α-DAPI共定位数目在大鼠海马结构各个区域及三区总量中都呈正相关性(CA1:r2=0.773,P<0.01;CA3:r2=0.497,P<0.05;DG r2=0.511,P<0.05;三区总量:r2=0.698,P<0.05)。NIX荧光强度与HIF-1α-DAPI共定位数目在大鼠海马结构各个区域及三区总量中都呈正相关性(CA1:r2=0.673,P<0.01;CA3:r2=0.570,P<0.01;DG:r2=0.431,P<0.05;三区总量:r2=0.803,P<0.01)。结论4.1 2VO大鼠为VD可靠模型。4.2 2VO大鼠海马结构存在低氧状态,氧化应激增强,凋亡水平升高,为参与形成VD的可能机制。此外,海马结构线粒体自噬水平增强,亦可能在VD发生发展过程中发挥着作用。4.3番茄红素三个药物剂量组中,以低剂量番茄红素预防VD效果最佳,因此适量的番茄红素可有效预防VD。4.4在低氧状态下NIX参与的线粒体自噬水平升高,抗氧化剂的预防性应用可拮抗氧化应激诱导的NIX参与的线粒体自噬。