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红铃虫Pectinophora gassypiella是世界上最重要的棉花害虫之一,曾经长时间在我国长江流域棉区造成严重危害。自该区域种植转Bt基因棉花(以下简称Bt棉)以来,红铃虫群得到了有效控制。然而,随着Bt棉种植比例的不断上升,已经检测到该区域田间红铃虫种群对Cry1Ac的敏感性下降。为了寻找有效抑制红铃虫对Bt棉抗性发展的方法,本文从长江流域棉区采集红铃虫田间个体,将其与室内抗性个体进行单对配对,从中筛选并纯化出了多个红铃虫Cry1Ac抗性品系;通过分子生物学手段,明确了这些品系对Cry1Ac蛋白的抗性机理及其遗传规律,建立了相应的抗性基因分子检测方法。主要结果如下: 1)从田间筛选并纯化了4个红铃虫Cry1Ac抗性品系,分别为AQ65、AQ47、AQ189与JL88,这4个品系对Cry1Ac原毒素蛋白的抗性倍数分别为:304、220、254与289倍,并且均为常染色体偏隐性遗传;其中AQ65、AQ47与AQ189品系对Cry2Ab有低水平的交互抗性(分别为2.60、2.09与1.82倍),而JL88品系对Cry2Ab没有交互抗性。 2)这4个抗性品系均是PgCad发生突变且该突变与Cry1Ac抗性完全连锁。与敏感红铃虫gCad相比,PgCad189与gCad88的基因组DNA分别插入了一个234 bp与3370 bp的片段,PgCad47缺失了一个314 bp的片段,而PgCad65则既缺失了549 bp又插入了198 bp。 3)针对4个抗性品系PgCad的突变位点设计了8对特异性引物,用于检测4种抗性等位基因及其基因型。2012-2015年长江流域红铃虫的抗性基因频率检测结果表明:PgCad47、PgCad189与PgCad88在田间的平均频率分别为0.0003、0.0002与0.0003,并且4年间没有显著性差异。 4)所有品系均能在常规棉棉铃上完成生活史;4个抗性品系亦能在转Cry1Ac棉棉铃上完成生活史,但其存活率低于常规棉棉铃并且发育历期显著延长、蛹重显著降低;而敏感品系则不能在转Cry1Ac棉棉铃上完成生活史。 5)将红铃虫PgCad基因与GFP基因构建表达载体,在TnH5昆虫细胞中表达融合蛋白并定位:表达敏感红铃虫PgCad-GFP的TnH5细胞对Cry1Ac活化蛋白的半效应浓度(EC50)为6.79μg/ml,表达抗性红铃虫钙粘蛋白的TnH5细胞EC50均大于40μg/ml;敏感红铃虫的PgCad-GFP主要定位在细胞膜上,而对于抗性红铃虫,除了PgCad88A-GFP能定位到细胞膜上外,PgCad47-GFP、PgCad65-GFP滞留在内质网上,PgCad189-GFP主要定位在囊泡上。 6)红铃虫成虫饲喂Cry1Ac实验结果表明:与对照组相比,饲喂10、40与160μg/ml Cry1Ac蛋白的抗、感品系产卵期均显著缩短、产卵量显著下降,但成虫寿命、产卵率、产卵前期与卵孵化率没有差异。当蜂蜜水中的Cry1Ac蛋白提高到160与640μg/ml Cry1Ac时,与对照组相比,抗、感品系的成虫寿命均显著缩短,并且抗性成虫的寿命显著高于敏感成虫。 上述结果表明长江流域红铃虫携带着Bt抗性基因,该抗性基因主要是钙粘蛋白等位基因,为常染色体隐性遗传,但其抗性基因频率尚处于较低水平,且对Cry2Ab有低水平甚至没有交互抗性。这些研究结论的取得,为延缓长江流域红铃虫对Bt棉抗性的发展,制定合理的红铃虫对Bt棉抗性治理策略提供了技术支撑。