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核心结合因子(core-binding factor α1,cbfal)是近几年发现的与骨发育密切相关的转录因子,在成骨细胞分化和骨形成过程中发挥重要作用。cbfal是调控成骨细胞特异性基因表达的主控基因,该基因只在与成骨相关的细胞中表达,如果在非成骨细胞中强制表达,则该细胞出现成骨细胞的特征。在基因敲除实验中,cbfal缺陷纯合鼠无骨的形成,杂合鼠则出现成骨细胞功能下降,包括成骨细胞数量减少、组织中骨基质蛋白缺乏以及碱性磷酸酶活性降低等。所有研究均表明cbfal在骨形成中具有重要地位。 目前对cbfal的研究多集中于骨发育及成骨细胞分化方面,关于cbfal与机械力介导的正畸成骨的相关性研究尚未见报道。正畸牙槽骨改建包括破骨和成骨两个过程,是正畸牙齿移动中的主要生物学过程。牙周膜细胞是正畸力的效应细胞,可能同时参与了正畸牙槽骨改建的成骨和破骨过程,并发挥重要作用。因此,研究牙周膜细胞在机械应力作用下cbfal的表达,对于 第四军医大学博士学位论文3 探讨牙周膜细胞和Cbfal在正畸成骨中的作用机制以及正畸牙齿移动的机理 都是有意义的。因cbfal的检测试剂尚未商品化,所以本研究从基因克隆入 手,自制了Cbfal的抗体和探针,采用免疫组化和原位杂交的方法,检测了 人牙周膜细胞在弹性牵张力作用下Cbfal的表达,初步探讨Cbfal在正畸成骨 中的作用机制。研究内容如下: 一、大鼠颅骨成骨细胞的原代培养和鉴定 目的:体外原代培养大鼠颅骨成骨细胞,为下一步的基因克隆实验提供 细胞来源。方法:采用组织块法体外原代培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞, 并利用差数贴壁法进行纯化。用碱性磷酸酶活性检测和钙化结节 VOn Kossa 染色进厅鉴定。结果:原代培养的成骨细胞呈立方形、多角形或短梭形,细 胞融合后呈“菊花状”复层重叠生长,细胞能在体外形成钙化结节。钙钻法 碱性磷酸酶染色阳性,钙化结节 Von Kossa k色阳性。结论:本实验在体外 成功培养出了大鼠颅骨成骨细胞。 二、大鼠颅骨成骨细胞Cbfal CDNA片段的克隆和序列测定 目的:从体外培养的大鼠颅骨成骨细胞中克隆出Cbfal CDNA片段,为 进一步的抗体和探针制备奠定基础。方法:采用RT-PCR方法。结果:从大 鼠颅骨成骨细胞总RNA中克隆出约700hp大小的Cbfal CDNA片段,测序结 果与GenBank检索到的相同。结论:本实验成功克隆出了大鼠的cbfa cDNA 片段。 三、大鼠Cbfal CDNA肽段在大肠杆菌中的表达和纯化 3 第四军医大学博士学位论文4 目的:在大肠杆菌中表达cbfal cDNA肽段,制备。bfal纯化蛋白,为抗 体的制备奠定基础。方法:构建重组质粒,诱导蛋白表达,用* 柱亲、和层析纯化融合蛋白。结果:在构建的重组质粒中正确插入了约200hp的 cbfal cDNA片段,在大肠杆菌表达并纯化后获得纯度大于95%的cbfal融合 蛋白。结论:本实验在体外以大肠杆菌为宿主菌表达出了Cbfal多肽片段, 获得了高纯度的Cbfal融合蛋白。 四、大鼠 cbfal 多克隆抗体和 cDNA探针的制备 目的:制备Cbfal多克隆抗体和。DNA探针,为免疫组化和原位杂交研 究奠定基础。方法:用新西兰大白兔进行动物免疫,兔抗血清进行分离和纯 化。用双向免疫扩散试验、蛋白印迹和免疫组化方法进行鉴定。Cbfal重组质 粒扩增后酶切,用随机引物法对回收的Cbfal CDNA片段进行地高辛标记。 结果:制备的Cbfal多克隆抗体经双向免疫扩散试验、蛋白印迹检测、新生 大鼠颅骨组织石蜡切片和 MG-63骨肉瘤细胞免疫组化染色鉴定,均为阳性结 果。制备了地高辛标记的Cbfal CDNA探针。结论:本实验成功制备了Cbfal 多克隆抗体和 CDNA探针。 五、人牙周膜细胞在弹性牵张力作用下Cbfal的表达 目的:探讨人牙周膜细胞在张应力作用下的成骨特性和Cbfal在正畸成骨。中的作用机制。方法:体外原代培养人牙周膜细胞,弹性膜及体外培养细胞 加载系统加载弹性牵张力,免疫组化和原位杂交方法检测人牙周膜细胞在弹 性牵张力作用下cbfal在蛋白水平和基因水平的表达。结果:体外原代培养 4 第四军医大学博士学位论文5 的人牙周膜细胞形态为短梭形和长梭形,细胞呈放射状生长;加力后的人牙