本实验室已成功地将施氏假单胞菌A1501（Pseudomonas stutzeri A1501）的固氮岛转入大肠杆菌DH10B（Escherichia coli DH10B）中，获得了具有固氮活性的重组大肠杆菌EN-01。然而EN-01的固氮活性仅为野生型A1501的十分之一。生物固氮是一个复杂的调控过程，涉及一系列信号转导和效应蛋白的参与。然而转入大肠杆菌的固氮岛内并不包含这些调控基因，因此需要重组大肠杆菌一般氮代谢调节网络中的相应蛋白负责参与其固氮过程的调控。在施氏假单胞菌中，一般氮代谢调节蛋白NtrC是在氮限制条件下激活固氮岛内基因表达的关键，同时也是激活许多参与氮吸收和代谢的基因表达所必需的。而在重组大肠杆菌EN-01中，一般氮代谢调节蛋白GlnG是其氮限制条件下选择性氮源同化途径中的全局激活子，因此它能否像NtrC一样有效地参与调节异源固氮岛内相关基因的表达以及其调控效率如何，对重组大肠杆菌EN-01的固氮活性将有重要影响。因此本论文主要围绕大肠杆菌GlnG蛋白对外源固氮岛内基因表达的调控功能进行相关研究。主要结果如下：1.本研究通过生物信息学分析发现DH10B GlnG和A1501NtrC具有相似的结构。其中DH10BGlnG与A1501NtrC的氨基酸序列一致性约为65.35%。两个蛋白质的二级结构组成及高级结构也非常相似，并且两蛋白质的分子量、等电点等理化性质非常接近。2.本研究证实了DH10B GlnG和A1501NtrC在一般氮代谢和固氮过程中的功能互补性。利用DH10B GlnG互补A1501NtrC突变株得到的功能互补株不仅能够在以硝酸钾或尿素为唯一氮源的培养基上生长，而且具有一定的固氮活性，约为野生型A1501固氮活性的45%，同时利用A1501NtrC互补DH10B GlnG突变株得到的功能互补株能够在以精氨酸为唯一氮源的培养基上生长。由此可知在重组大肠杆菌中GlnG能够参与固氮基因的表达调控，但是与A1501NtrC相比固氮调控能力偏低，这可能是导致重组大肠杆菌固氮活性较低的原因之一。3.本研究证实了磷酸化GlnG蛋白能够体外结合异源固氮岛内的正调节基因nifA的启动子区。因为GlnG蛋白仅在磷酸化的状态才能激活受其调控基因的转录，所以获得磷酸化的GlnG蛋白（GlnG-P）是研究该蛋白与目的基因相互作用的前提条件。本研究采用融合PCR的方法将大肠杆菌DH10B GlnG氨基酸序列的第54位氨基酸从天冬氨酸替换为谷氨酸，第160位氨基酸从丝氨酸替换为苯丙氨酸，实现了不需要被NRII磷酸化就能够激活转录的GlnG-P蛋白的组成型表达，然后体外分离纯化得到了GlnG-P蛋白。接下来通过凝胶阻滞实验证实了重组大肠杆菌GlnG-P蛋白能够与A1501固氮岛内nifA基因的启动子区发生结合即互作。由此可知在重组大肠杆菌中磷酸化的GlnG蛋白能够直接与nifA基因启动子区结合来调控固氮岛内其他相关基因的表达。上述研究结果为进一步明确大肠杆菌GlnG蛋白对外源固氮岛表达的调控功能及研究重组菌生物固氮的调控网络，优化重组菌的固氮活性奠定了基础。