有效性和毒性是候选化合物临床失败的主要原因。毒性也是上市新药被撤市或限制使用的根本原因。肝脏是药物体内代谢的重要器官,也是药物毒性的最重要的靶器官。因此,系统研究候选化合物肝毒性,特别是在新药发现早期,对于优化候选化合物质量、提高新药研发效率具有重要意义。高内涵分析(High Content Analysis,HCA)是一种基于细胞表型分析的高效新药筛选技术。HCA能兼顾样品特异性、毒性、生物可溶性和生物利用率,弥补了现有发现毒理学筛选系统在通量、毒性机制检测、潜在毒性揭示全面性等方面的不足,为发现毒理学研究提供新的有效的技术。目前HCA能够实时、动态监测体外肝细胞毒性的多个参数、毒理学机制相关的多个重要的标志分子,包括细胞及亚细胞形态与数量、细胞膜完整性、细胞凋亡相关改变、氧化应激及DNA损伤的变化等,是评估候选药物肝细胞毒性、预测候选化合物肝毒性的高效手段。本课题的研究目的是:采用HCA技术进行候选化合物的肝细胞毒性的研究;在此基础上启动化合物结构和肝细胞毒性表型数据库的建设工作,为实现预测候选化合物肝毒性的终目标奠定工作基础。本研究工作由四部分内容组成:第一部分,候选化合物肝细胞毒性的多参数研究;第二部分,候选化合物诱导肝细胞凋亡的多参数研究;第三部分,候选化合物诱导肝细胞氧化应激和DNA损伤研究;第四部分,化合物结构和毒性细胞表型数据库的初步建设。第一部分工作主要是在MTT法检测候选化合物对肝(HepaG2)细胞活力的基础上,采用Cellomics公司多参数细胞毒性检测试剂盒,通过HCA技术观察本实验室基于四种靶标的9个候选化合物急性(4h)、亚急性(24h)和慢性(72h)处理,诱发的HepaG2细胞数量、核亮度、核面积、核大小、细胞膜完整性、线粒体膜电位、细胞色素C的释放的变化。结果发现,候选化合物处理HepaG2细胞72h,过氧化合物酶体增殖体激活受体(PPAR) /γ(PPAR /γ)双重激动剂C333H和P633H、PPAR /激动剂F3SM和F3SMDM抑制肝细胞增殖的IC50分别为(161.57±15.29),(101.08±17.58),(74.06±7.44)和(107.40±14.09)μM;晚期糖基化终产物(AGEs)裂解剂C36和C36D2、大麻素受体-1(cannabinoid receptor 1,CB1)拮抗剂MJ07和MJ08抑制肝细胞增殖的IC50均大于300μM;CB1拮抗剂MJ15的IC50为(117.62±26.15)μM。在多参数细胞毒实验中,候选化合物C333H、P633H、F3SM、F3SMDM、MJ07、MJ08和MJ15对HepG2细胞的毒性表现为具有时间依赖性和剂量依赖性的特点。线粒体损伤是C333H、P633H诱发的早期细胞毒反应,是贯穿F3SM和F3SMDM急性、亚急性、慢性毒性中的主要毒性反应,是C333H、P633H、F3SM和F3SMDM产生细胞毒性的主要原因;线粒体损伤、细胞膜损伤是MJ07、MJ08诱发细胞毒性的早期反应,MJ07作用强于MJ08;线粒体损伤、细胞膜损伤与细胞增殖抑制是MJ15细胞毒的共同反应,在亚急性毒性反应中,MJ07和MJ15还表现出阻滞细胞分裂的作用。C333H低于100μM,P633H、F3SM、MJ07、MJ08低于30μM,MJ15低于10μM,F3SMDM在低于3μM无明显的细胞毒性。C36和C36D2在本实验的浓度范围内3-300μM未表现出细胞毒反应。第二部分工作,采用Cellomics公司多参数细胞凋亡检测试剂盒,观察9种候选化合物处理HepG2细胞30h,对细胞数量、细胞核亮度、核面积、核DNA含量、F-actin短长轴比、F-actin亮度和线粒体膜电位七个参数的影响,发现:C333H、P633H、F3SM、F3SMDM在100μM诱发细胞核固缩反应,在300μM诱发线粒体膜电位的增加;MJ07、MJ08在30μM,MJ15在10μM诱发细胞核固缩反应,三者分别在3μM、30μM、10μM开始诱发线粒体膜电位的增加;P633H诱导细胞凋亡的强度与C333H相似,但非凋亡的细胞毒作用强于C333H;F3SM和F3SMDM抑制细胞增殖的浓度低于诱发凋亡浓度;MJ07、MJ08、MJ15诱导凋亡的浓度分别是低于、等于、高于其抑制细胞增殖的浓度。C36和C36D2在3-300μM未表现出诱导细胞凋亡的相关变化。第三部分工作,采用Millipore公司高内涵分析专用MnSOD和Histone H2A.X Phosphorylation试剂盒,观察化合物急性、亚急性、慢性处理细胞,候选化合物导致的HepG2细胞MnSOD、pHH2A.X的影响。发现:化合物C333H、P633H在300μM浓度下诱发细胞产生氧化应激反应(MnSOD升高)和DNA损伤作用(pHH2A.X表达升高),F3SM在300μM、F3SMDM在200μM浓度下主要诱发细胞产生氧化应激反应,上述损伤反应主要发生在急性和亚急性处理期;MJ07在100μM及以上浓度有诱发细胞产生氧化应激作用(MnSOD升高),但无DNA损伤作用;MJ08在100μM浓度以下轻度降低MnSOD表达,对氧化应激无显著影响,但在100μM以上浓度有损伤细胞DNA的作用(pHH2A.X表达升高);MJ15在0.30~10μM轻度降低MnSOD表达,30μM以上浓度具有显著的诱发细胞氧化应激和DNA损伤作用。第四部分工作,将本课题采用HCA研究获得的9种候选化合物的细胞毒性、凋亡和氧化应激及DNA损伤等肝细胞毒性的数据汇总,计算IC50或EC50,初步制得化合物肝细胞毒性的细胞表型库雏形,并采用NCSS Statistical and Data Analysis 2007进行聚类分析(最小距离法),聚类结果显示9种化合物可分成3类,第一类为F3SMF3SMDM、C333H、MJ08、C36C36D2;第二类为P633H和MJ07;第三类为MJ15。通过上述4部分的实验,本研究获得以下结论:1)PPAR /γ激动剂C333H和P633H①对HepG2细胞的毒性作用具有时间依赖性和剂量依赖性。线粒体损伤是两化合物的早期损伤反应,是C333H和P633H产生细胞毒性的主要原因之一。C333H在低于100μM,P633H在低于30μM无明显的细胞毒性。P633H细胞毒性强于C333H;②二者在100μM有诱导HepG2细胞凋亡的现象,P633H诱导细胞凋亡的强度与C333H相似,但非凋亡的细胞毒作用强于C333H;③二者在300μM均产生氧化应激和DNA损伤作用。C333H在1-100μM和P633H在0.3-30μM无明显氧化应激和DNA损伤作用,属于安全剂量。2) PPAR /激动剂F3SM和F3SMDM①对HepG2细胞的毒性作用具有时间依赖性和剂量依赖性。两候选化合物的急性、亚急性和慢性毒性是以线粒体损伤为主(线粒体膜电位降低)。F3SM在低于30μM,F3SMDM在低于3μM无明显的细胞毒性。F3SMDM细胞毒性强于F3SM;②二者在100μM时有诱导HepG2细胞凋亡的现象;③F3SM在300μM和F3SMDM在200μM产生氧化应激作用,二者均无DNA损伤作用,在30μM内二者无氧化应激和DNA损伤作用。3) AGEs裂解剂C36和C36D2①3-300μM范围内无明显细胞毒性;②在300μM内无诱导HepG2细胞凋亡的现象;③二者在300μM无氧化应激和DNA损伤作用。4)靶向CB1的化合物MJ07、MJ08和MJ15①对HepG2细胞的毒性作用具有时间依赖性和剂量依赖性。线粒体损伤和膜完整性破坏是其产生细胞毒性的主要原因之一。三种化合物的细胞毒性以MJ15最强,其次为MJ07,MJ08毒性最弱;②三者在30μM有诱导HepG2细胞凋亡的现象,此时MJ08和MJ15显著抑制细胞增殖;③MJ07在100μM及以上浓度有氧化应激作用,但无DNA损伤作用,MJ08在100μM及以上浓度有DNA损伤作用,MJ15在30μM及以上浓度有明显氧化应激和DNA损伤作用。MJ08和MJ15的表型更为相近,与药效学的表现相似。5)在获得的9种候选化合物的细胞毒性表型数据的基础上,建立候选化合物毒性细胞表型数据库的雏型,并进行了初步的聚类分析。