目的:1.建立蜡样芽胞杆菌的多重PCR快速检测方法,对福州市80株蜡样芽胞杆菌10种毒力基因进行快速检测,同时对不同的芽胞菌进行快速鉴定。2.建立蜡样芽胞杆菌PFGE分型方法,对52株蜡样芽胞杆菌进行PFGE分型和同源性分析,对不同地区、不同时间采集的食品进行追踪和溯源,为控制疾病提供科学依据。方法:1.采集米粉、奶粉等婴儿食品300份,通过增菌、分离培养和生化试验,分离食品中蜡样芽胞杆菌。2.以蜡样芽胞杆菌的hblA,hblC,nheA,nheB,cytK,cer,entFM、bceT基因和苏云金芽胞杆菌的cry基因以及炭疽芽胞杆菌的pag基因设计引物,优化反应条件,对蜡样芽胞杆菌与苏云金芽胞杆菌进行快速鉴定,并建立蜡样芽胞杆菌毒力基因的多重PCR检测方法。3.对福州市80株蜡样芽胞杆菌进行毒力基因检测,同时应用单一引物PCR和国标法对多重PCR检测结果进行确认和比较。并以20株李斯特菌、10株金黄色葡萄球菌和10株沙门氏菌作毒力基因的阴性对照。4.将蜡样芽胞杆菌的胶块置于溶菌酶溶液中37℃水浴摇床孵育6h进行裂解,然后加蛋白酶K裂解液置54℃水浴摇床中孵育过夜。分别用NotI、SbaI和SmartI三种酶及不同的酶浓度和不同消化时间对蜡样芽胞杆菌进行PFGE分型条件摸索。5.对52株分离自婴幼儿食品的蜡样芽胞杆菌进行PFGE分型,细菌全基因组经NotI限制性内切酶酶切,脉冲场凝胶电泳,用Bionumerics 5.10.软件分析结果。结果:1.婴儿食品蜡样芽胞杆菌(Bc)检出情况300份婴幼儿奶粉、米粉中,有80份检出Bc,检出率达26.66%(80/300),定量值为10~800CFU/g。2.用单重PCR检测蜡样芽胞杆菌10种毒力基因,溶血性基因hblA和hblC检出率分别为57.5%和25%,非溶血性基因nheA、nheB检出率分别为75.0%和80.0%,细胞毒素cytK基因检出率为37.5%。肠毒素entFM和bceT检出率分别为28.7%和18.7%。蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的cer基因检出率分别为97.5%和100%,cry基因检出率分别为0%和100%,两菌均不带pag基因。毒力基因检出情况与Mousumi banerjee报道相符。3.用多重PCR检测蜡样芽胞杆菌的10种毒力基因,溶血性基因hblA和hblC检出率分别为56.3%和25.0%,非溶血性基因nheA、nheB检出率分别为73.8%、77.5%,细胞毒素cytK基因检出率为36.2%。肠毒素entFM和bceT检出率分别为17.5%和20.0%。蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的cer基因检出率分别为97.5%和100%,cry基因检出率分别为0%和100%,两菌均不带pag基因。单重PCR和多重PCR检测结果符合率高,没有显著性差异,电泳条带清晰,三对引物所扩增出的DNA条带明显区分开,多重PCR检测各毒力基因的灵敏度是102CFU/mL。4.用20株李斯特菌、10株金黄色葡萄球菌和10株沙门氏菌作毒力基因对照检测,均未检出相应片段。说明本方法检测特异性强。5.蜡样芽胞杆菌PFGE分型的反应条件为:蜡样芽胞杆菌用溶菌酶37℃水浴摇床孵育6h进行裂解,选择NotI作为内切酶,酶浓度为10U/μl,作用时间为3h。6.来源于福州市疾病控制中心实验室的52株蜡样芽胞杆菌同源性分析的结果:以100%相似度为标准,52个菌株可以分成47种不同的PFGE型别,没有集中优势型别;有5株来自不同厂家和不同生产日期的菌株PFGE型别相同。结论:1.本实验建立的多重PCR检测方法敏感度高,特异性强,大大节省了检验工作量和检验时间,达到对样品进行快速检测的目的。三重PCR检测结果非常理想,有利于快速准确报告检验结果,具有重要的实际意义。2.优化了蜡样芽胞杆菌PFGE分型的反应条件,成功建立蜡样芽胞杆菌PFGE分型方法。本方法重复性高,分辩力强,能满足分型的需要,可对不同地区、不同时间采集的食品进行追踪和溯源,为蜡样芽胞杆菌引起的食源性疾病及医院感染的溯源提供了有效的技术手段。对于减少由蜡样芽胞杆菌引起的给食品工业带来的损失和控制疾病的进一步传播具有重要意义。