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激肽释放酶是一种丝氨酸蛋白水解酶,主要分为血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶两大类,其中,组织激肽释放酶已经被制成药品广泛应用于治疗高血压、心绞痛、动脉粥样硬化、男性不育、微循环障碍等疾病,受到医药工业高度重视。
工业化生产中一般以来源比较广泛的猪胰脏为原料提取纯化组织激肽释放酶,主要分离纯化方法有有机溶剂或盐分级沉淀、凝胶过滤、离子交换、亲和层析等。离子交换技术主要根据蛋白质在不同pH值缓冲液中所带电荷不同达到分离目的,而亲和层析技术是利用被分离物质与其特异性配基间的亲和力进行分离。
本研究采用改进方法从猪胰脏中提取激肽释放酶粗酶,通过正交试验,优化的提取条件为:0.05MNaAc-HAcpH5.0缓冲液,提取液体积为猪胰脏质量的3倍,Ca2+浓度为10%。得到的粗酶利用DEAE-Sepharose4B离子交换,对-氨基苯甲眯-Sepharose4B亲和层析技术进一步纯化,得到了较高纯度的激肽释放酶产品。研究确定DEAE-Sepharose4B离子交换纯化激肽释放酶的条件为:上样液为0.02MNaAc-HAcpH5.5缓冲液,洗脱液为0.02MNaAc-HAc-0.36NaClpH5.5溶液;利用亲和层析技术做进一步纯化,采用对-氨基苯甲脒-Sepharose4B亲和层析方法,纯化工艺条件为:上样液为0.1MPBpH7.0,洗脱液为0.1MPB-0.5MNaClpH7.0溶液。
激肽释放酶粗酶经过DEAE-Sepharose4B离子交换和对-氨基苯甲脒-Sepharose4B亲和层析纯化,所得激肽释放酶产品比活为300.00KU/mg.p左右。DEAE-Sepharose4B离子交换纯化倍数约为6倍;对-氨基苯甲脒-Sepharose4B亲和层析纯化倍数约为45倍。激肽释放酶效价回收率为56%-59%,获得的激肽释放酶产品经SDS-PAGE电泳,获得单一条带,纯度较高。
在获得DEAE-Sepharose4B和对-氨基本甲脒-Sepharose4B小试操作参数的基础上,对整个工艺进行放大,进行批次重复试验,研究操作过程中参数的稳定性,同时,还对激肽释放酶纯化工艺的重复性进行验证,在此基础上确定了适用于生产的小试工艺。