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目的结肠癌组织中浸润的中性粒细胞多发挥促肿瘤的作用,减少中性粒细胞的浸润,是防治结肠癌的潜在途径。本课题以中性粒细胞浸润为切入点,探讨草本多糖合剂（其成分为酵母胞壁多糖+鱼腥草水提液）对小鼠结肠癌防治的作用及机制,为开发研究防治结肠癌药物提供实验依据。方法1.结肠癌小鼠模型的制备1,2-二甲基肼（1,2-Dimethylhydrazine,DMH）/葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium,DSS）联合循环用药制备结肠癌小鼠模型:SPF级雄性昆明小鼠第1周采用DMH 20mg/kg进行一次腹腔注射,第2周将小鼠饮用水换为含3%DSS的水溶液,自由饮用1周,第3周和第4周饮用纯净水,4周为一个循环,连续三个循环即12周后,为模型制备完成。2.给药及分组预防阶段:SPF级雄性昆明小鼠按体质量随机分为正常组、模型组、预防组。模型组与预防组小鼠均按上述方法造模,而预防组小鼠在造模同时进行预防给药干预,以草本多糖合剂灌胃,剂量为40 mg/kg,于12周后处死小鼠取材。治疗阶段:SPF级雄性昆明小鼠按体质量随机分为正常组与模型组,模型组小鼠按上述方法造模,每周称重一次,记录小鼠体重及稀便、便血、脱肛情况。第4、8、12周于两组各随机抽取2只小鼠取出结肠肉眼观察,并通过HE染色检测结肠病理形态,判断结肠癌模型建立情况。造模成功后将剩余模型小鼠随机分为模型组、草本多糖合剂低、中、高剂量组、阳性组、联合组。正常组与模型组小鼠给予生理盐水,草本多糖合剂低、中、高剂量组给予草本多糖合剂,剂量分别为20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg,阳性组给予5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）,剂量为20 mg/kg,联合组给予草本多糖合剂40mg/kg+5-Fu 20 mg/kg,治疗8周后处死小鼠取材。3.指标检测方法（1）一般状况及结肠组织观察:实验过程中每周称重一次,记录小鼠体重变化及稀便、便血、脱肛情况;实验结束摘取小鼠结肠组织,肉眼观察小鼠结肠占位、结肠长度及结肠损伤情况。（2）免疫器官指数测定:实验结束摘取小鼠胸腺及脾脏组织,称重后按相应公式计算胸腺指数与脾脏指数。（3）外周血中性粒细胞与淋巴细胞比率（Neutrophils to lymphocytes ratio,NLR）分析:实验结束摘眼球取小鼠外周血,立即用XT-2000 i V血常规分析仪检测外周血中性粒细胞、淋巴细胞计数,分析外周血NLR。（4）病理形态观察:实验结束摘取小鼠结肠组织进行苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色,镜下观察结肠组织的病理损伤情况。（5）中性粒细胞标志物测定:实验结束摘取小鼠结肠组织进行免疫组化染色,检测结肠肿瘤组织中Ly6G+细胞表达,观察中性粒细胞的浸润情况。（6）蛋白表达测定:为分析浸润性中性粒细胞相关促肿瘤蛋白表达,实验结束摘取小鼠结肠组织,采用蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）检测结肠肿瘤组织中CXC类趋化因子配体2（CXC chemokine ligand 2,CXCL 2）、精氨酸酶1（Arginase 1,Arg 1）、基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9,MMP 9）、诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,i NOS）的蛋白表达。结果1.草本多糖合剂对DMH/DSS诱导的小鼠结肠癌的预防作用及机制（1）对小鼠体重及稀便、便血、脱肛情况的影响正常组小鼠在实验过程中状态良好,无稀便、便血及脱肛表现,体重呈正常增长趋势;与正常组比较,模型组小鼠状态较差,于第2周开始逐步出现稀便及便血表现,于第10周开始逐步出现脱肛情况,且实验过程中小鼠体重呈明显下降趋势;与模型组比较,预防组小鼠稀便、便血及脱肛情况有所减轻,小鼠体重明显回升。表明草本多糖合剂预防干预,可明显改善结肠癌导致的小鼠体重减轻及稀便、便血、脱肛情况。（2）对结肠长度、损伤评分及免疫器官指数的影响与正常组比较,模型组小鼠结肠长度显著缩短（P＜0.001）,结肠损伤评分显著升高（P＜0.001）,胸腺指数与脾脏指数显著降低（P＜0.001）;草本多糖合剂预防干预后,与模型组比较,预防组小鼠结肠长度趋于正常（P＜0.01）,结肠损伤评分显著降低（P＜0.001）,胸腺指数显著升高（P＜0.001）,脾脏指数明显升高（P＜0.05）。表明草本多糖合剂预防干预,可明显改善结肠癌发生发展过程中的结肠缩短及损伤情况,提高小鼠免疫器官指数,增强机体免疫功能。（3）对发瘤率及结肠组织病理变化的影响肉眼观察结肠占位情况,结果显示:正常组小鼠结肠无占位,模型组小鼠20只均有肉眼可见占位,预防组小鼠20只,其中18只有肉眼可见占位。进一步采用HE染色确定小鼠发瘤情况,结果显示,模型组小鼠均为原位癌,发瘤率为100%,预防组小鼠14只为原位癌,4只为中度或重度非典型增生,发瘤率为70%。且观察结肠病理损伤发现,正常组小鼠结肠无明显组织学改变,腺体结构正常,排列整齐,可见大量空泡状杯状细胞;模型组小鼠结肠腺体丧失圆管状,呈不规则型,排列拥挤紊乱,细胞异型性改变,明显核大深染,出现病理核分裂象;草本多糖合剂预防干预后,腺体拥挤紊乱及肿瘤细胞异型性得到改善,可见少量杯状细胞。表明草本多糖合剂预防干预,可改善小鼠结肠组织的病理损伤,降低结肠癌的发瘤率。（4）对结肠肿瘤组织中性粒细胞浸润的影响免疫组化染色结果显示,与正常组比较,模型组小鼠Ly6G+细胞表达显著升高（P＜0.01）,表明中性粒细胞在结肠肿瘤组织中的浸润显著增多;与模型组比较,预防组小鼠Ly6G+细胞表达显著降低（P＜0.001）,表明中性粒细胞在结肠肿瘤组织中的浸润显著减少。（5）对结肠肿瘤组织CXCL 2、Arg 1、MMP 9、i NOS蛋白表达的影响WB结果显示,与正常组比较,模型组小鼠结肠肿瘤组织中CXCL 2、Arg 1、MMP9、i NOS蛋白表达显著升高（P＜0.01,P＜0.001）;与模型组比较,预防组小鼠结肠肿瘤组织中CXCL 2、Arg 1、MMP 9、i NOS蛋白表达明显降低（P＜0.05,P＜0.01）。表明草本多糖合剂可降低浸润性中性粒细胞相关促肿瘤蛋白表达。2.草本多糖合剂对DMH/DSS诱导的小鼠结肠癌的治疗作用及机制（1）DMH/DSS结肠癌小鼠模型的鉴定正常组小鼠在实验过程中状态良好,无稀便、便血及脱肛表现,体重呈正常增长趋势;与正常组比较,模型组小鼠状态较差,于第2周开始逐步出现稀便及便血表现,第10周逐步出现脱肛情况,实验过程中小鼠体重明显低于正常组（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）。第4周取出结肠肉眼观察发现,正常组小鼠与模型组小鼠结肠均无粘连,肠壁厚薄均匀,肠黏膜光滑平整,无充血、糜烂及肿块;第8周模型组小鼠结肠与周围组织轻度粘连,结肠较正常组小鼠略有缩短增厚,肠粘膜轻度充血,无糜烂及肿块;第12周模型组小鼠结肠与周围组织粘连严重,较难分离,结肠较正常组小鼠明显缩短增厚,肠黏膜充血较重,出现多发性肿块。HE染色结果显示:正常组小鼠结肠组织结构规则且腺体排列整齐;模型组小鼠结肠逐渐出现非典型增生,第12周结肠组织腺体丧失圆管状,呈不规则型且排列拥挤紊乱,癌细胞呈大小不等、形态不整的腺管样,细胞异型伴核大深染,可见病理核分裂象。提示DMH/DSS结肠癌小鼠模型造模成功。（2）对小鼠体重的影响正常组小鼠在实验过程中体重呈正常增长趋势;与正常组比较,模型组小鼠体重呈明显下降趋势;与模型组比较,各用药组小鼠体重出现不同程度回升,且草本多糖合剂中、高剂量组较明显。表明草本多糖合剂可明显改善结肠癌导致的小鼠体重减轻情况。（3）对结肠长度、损伤评分、免疫器官指数及外周血NLR的影响与正常组比较,模型组小鼠结肠长度显著缩短（P＜0.001）,结肠损伤评分显著升高（P＜0.001）,胸腺指数与脾脏指数显著降低（P＜0.01,P＜0.001）,外周血NLR显著升高（P＜0.001）;与模型组比较,各用药组小鼠结肠长度趋于正常（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）,结肠损伤评分明显降低（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）,外周血NLR明显降低（P＜0.05,P＜0.001）,草本多糖合剂高剂量组及联合组胸腺指数显著升高（P＜0.01）,草本多糖合剂低、中、高剂量组及联合组脾脏指数显著升高（P＜0.001）,阳性组胸腺指数明显降低（P＜0.05）,脾脏指数显著降低（P＜0.001）;与阳性组比较,联合组胸腺指数显著升高（P＜0.01）,脾脏指数显著升高（P＜0.001）。表明经草本多糖合剂治疗后,结肠癌小鼠结肠缩短及损伤情况得到明显改善,免疫器官指数明显升高,外周血NLR明显降低,且草本多糖合剂以高剂量综合效果最好。（4）对结肠组织病理变化的影响HE染色结果显示,正常组小鼠结肠无明显组织学改变,腺体结构正常,排列整齐,可见大量空泡状杯状细胞;模型组小鼠结肠腺体丧失圆管状,呈不规则型,排列拥挤紊乱,细胞异型性改变,明显核大深染,出现病理核分裂象;各用药组结肠腺体拥挤紊乱及肿瘤细胞异型性得到改善,可见空泡状杯状细胞,且草本多糖合剂以高剂量尤为明显,阳性组与联合组改善效果最佳。表明经草本多糖合剂治疗后,可改善结肠癌小鼠的结肠病理损伤。（5）对结肠肿瘤组织中性粒细胞浸润的影响免疫组化结果显示,与正常组比较,模型组小鼠Ly6G+细胞表达显著升高（P＜0.01）,提示中性粒细胞在结肠肿瘤组织中的浸润显著增多;与模型组比较,各用药组小鼠Ly6G+细胞表达显著降低（P＜0.01,P＜0.001）,提示中性粒细胞在结肠肿瘤组织中的浸润显著减少,且草本多糖合剂以高剂量效果最为明显,联合组效果最好。（6）对结肠肿瘤组织CXCL 2、Arg 1、MMP 9、i NOS蛋白表达的影响WB结果显示,与正常组比较,模型组小鼠结肠肿瘤组织CXCL 2、Arg 1、MMP 9、i NOS蛋白表达明显升高（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）;与模型组比较,各给药组小鼠结肠肿瘤组织CXCL 2、Arg 1、MMP 9、i NOS蛋白表达均显著降低（P＜0.01,P＜0.001）,且草本多糖合剂以高剂量效果最为明显,联合用药组效果最佳。提示草本多糖合剂可降低浸润性中性粒细胞相关促肿瘤蛋白表达。结论草本多糖合剂可抑制DMH/DSS诱导的小鼠结肠癌的发生发展,发挥防治结肠癌的作用,其机制可能与减少中性粒细胞浸润、抑制浸润性中性粒细胞相关促肿瘤蛋白表达有关。