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研究背景婴幼儿血管瘤(infantile hemangioma,IH)为最常见的婴幼儿良性肿瘤,女婴和早产儿中多见[1-3],IH大多见于头颈处的表浅部位,妨碍患者美观,且增殖期生长迅速,引发各种并发症,如:溃疡、出血、呼吸道梗阻、心衰等,严重者可危及生命,消退后也可遗留一系列美观方面的后遗症,因此常引起患儿及家属的心理障碍。IH的主要特点为瘤体内存在大量异常增殖的血管内皮细胞(endothelial cells,ECs),因此抑制ECs的增殖对于IH的防治有着极其重要的临床意义。虽然大部分IH可自行消退,但目前公认的观点主张尽早诊断、合理干预、抑制增长、促进消退[4]。2-DG,即2-脱氧-D葡萄糖,作为一种经典的糖酵解抑制物,自1950年起,便引起众多临床科研工作者广泛关注并被深入研究[5]。已有研究证实2-DG可以抑制多种肿瘤细胞(肺癌、乳腺癌、骨肉癌)的增生分化[6]。前期课题组发现2-DG在体外对HUVECs细胞有明显的生物学抑制作用,在构建的裸鼠IH模型中亦可以抑制移植瘤增殖[7]。至于其具体的作用机制,有文献报道[8,9]2-DG可与甘露糖竞争,抑制蛋白质的N-连接糖基化,导致细胞的未折叠蛋白在内质网中聚集,进而引起内质网应激(ERS),诱导细胞凋亡。另外有研究发现2-DG可诱导细胞自噬[10,11],且自噬现象常被视作细胞在应激环境下的一种自我保护作用。那么2-DG诱导的细胞自噬对HUVECs又会起到什么作用呢?众多研究发现,自噬与肿瘤、衰老、心血管疾病、神经退行性疾病、代谢疾病等有着密不可分的关系[12],特别是肿瘤,然而其在不同肿瘤或同一肿瘤的不同阶段的作用均不尽相同。自噬对细胞的作用具有两面性,既可以促进细胞生存,又可以诱导细胞死亡[13]。尽管大部分肿瘤细胞的自噬活性下调,但仍有一些肿瘤细胞自噬活性较高,例如大肠癌细胞、肺癌细胞及宫颈癌Hela细胞等[14]。有研究证实自噬上调可保护肿瘤细胞在恶劣环境下的生存。近期有研究发现在人体IH标本中存在自噬现象,且增殖期血管瘤中自噬相关分子Beclin1与survivin共表达,推测在增殖期IH中,自噬促进了内皮细胞的存活[15]。因IH是血管内皮细胞异常增生的良性肿瘤,明确自噬现象在IH发生发展中的表达活性及作用,对IH的防治提供新的靶点,以及2-DG更为高效的治疗IH,均有重要意义。实验目的本实验对2-DG如何防治IH开展了摸索性工作,体外实验则将常氧下待处理HUVECs分为对照组,不同浓度的2-DG组、2-DG联合甘露糖(mannose)组、阳性对照组(Tm组)、2-DG联合3-甲基腺素(3-MA)组,检测2-DG对HUVECs增殖、凋亡及自噬的影响情况,进而探讨2-DG诱导内皮细胞凋亡的具体机制及凋亡与自噬的内在联系。收集各阶段IH临床标本,通过HE染色观察增殖期和消退期IH内血管内皮细胞的增生程度、形态,利用TUNEL凋亡检测法比较两组之间的凋亡水平,利用免疫组化观察两组间Atg5表达水平以及免疫荧光法观察两组LC3-II表达水平,比较增殖期和消退期血管瘤的自噬相关分子的表达情况,初探婴幼儿血管瘤的自噬活性。实验方法1.MTS比色分析。将HUVECs移位种于96孔培养板,分成八组:实验1组为空白对照,实验2组、3组、4组2-DG的工作浓度为:0.05m M、0.5m M、5m M;5、6、7组在2、3、4组的基础上加入D-mannose,工作浓度为0.5m M。8组为Tm组,工作浓度为1ug/ml,Tm为N-连接糖基化抑制剂,可以诱导ERS,检测第二天各组的光密度值。2.Annexin V-PI流式细胞分析。将细胞分为Control、10mM 2-DG、2-DG 10mM+1m M D-mannose、2-DG 10m M+2m M 3-MA、2m M 3-MA组。各组药物作用于HUVECs 24h后,利用Annexin V-FITC/PI双染色法检测药物作用24h后HUVEC细胞凋亡。3.Western blot免疫印记实验检测GRP78蛋白表达。将细胞分为Control、2-DG10m M、2-DG 5m M、2-DG 10m M+1m M D-mannose、2-DG 5m M+1m M D-mannose、衣霉素1ug/ml组进行不同处理24h,收集细胞,利用western blot免疫印迹法检测蛋白表达水平,GAPDH为内参,计算目的条带的相对光密度。4.Western blot免疫印记实验检测Beclin1和Atg5蛋白表达。将细胞分为Control、10m M 2-DG、5m M 2-DG、2-DG 10m M+2m M 3-MA、2-DG 5m M+2m M 3-MA、2m M 3-MA组分别予以不同处理24h,收集细胞,利用western blot免疫印迹法检测蛋白表达水平,GAPDH为内参,计算目的条带的相对光密度。5.HE染色。收集临床婴幼儿血管瘤手术切除的组织标本,石蜡包埋,切片,经HE染色后,光学显微镜下观察增殖期和消退期IH内血管内皮细胞的增生程度、形态及间质。6.TUNEL凋亡检测。切片经TUNEL法染色后,根据凋亡细胞计数比较两组间的凋亡率差异,并以此评估增殖期和消退期IH组织内细胞凋亡水平。7.免疫组化酶标法。增殖期和消退期IH切片经免疫组化酶标法染色,观察两组间Atg5的表达水平差异。8.免疫荧光标记法。增殖期和消退期IH切片经免疫荧光标记,分析两组间LC3-II表达水平差异。实验结果2-DG组细胞增值活力明显降低,与对照组相比具有显著差异(P<0.01),且该抑制作用呈剂量依赖性;2-DG联合甘露糖组增殖活力有所增加,与单独2-DG组相比具有统计学差异(P<0.05);2-DG组凋亡率明显增加,与对照组相比具有统计学差异(P<0.01),2-DG联合甘露糖组细胞凋亡率减少,与单独2-DG组相比具有统计学差异(P<0.01);2-DG组GRP78蛋白水平增加,与对照组相比具有统计学差异(P<0.01),加入甘露糖后,GRP78蛋白水平减少,与单独2-DG组相比具有统计学差异(P<0.01);2-DG组Beclin1和Atg5蛋白表达均有所增加,与对照组相比具有统计学差异(P<0.01),3-MA预处理细胞抑制自噬后,2-DG诱导的细胞凋亡增多,Beclin1和Atg5蛋白表达也有所减少,与2-DG组相比具有统计学差异(P<0.01)。Tunel法测凋亡显示消退期IH组细胞凋亡率明显高于增殖期IH,且相比具有统计学差异(P<0.01);免疫组化结果显示增殖期IH组中Atg5的表达水平高于消退期血管瘤(P<0.01);免疫荧光结果显示增殖期IH组的LC3-II阳性表达细胞多于消退期IH组。结论体外实验发现:2-DG显著抑制HUVECs细胞增殖,诱导HUVECs细胞凋亡及自噬;内质网应激可能是介导2-DG诱导细胞凋亡的相关作用机制;2-DG诱导的细胞自噬则能抑制细胞凋亡。临床标本检测发现:消退期IH细胞凋亡水平比增殖期IH高;增殖期自噬活性较强,消退期自噬活性下调;自噬的下调有可能促进增殖期IH向消退期转化。