论文部分内容阅读
本文对鲫鱼(Carassius cuvieri)发育达Ⅳ期的卵母细胞进行玻璃化冻存,分析了两种不同的缓冲液(KCl缓冲液与D-Hank’s缓冲液)、不同玻璃化液配方(VS4与VSd)、不同预平衡方法(三步法与五步法)、不同冷冻天数(1d、2d、4d、6d、8d)及不同复温方法的效果比较,通过对鱼卵细胞玻璃化冻存前后的细胞存活率、琥珀酸脱氢酶(SDH)活性及丙二醛(MDA)含量的测定,通过单因素、多因素两种不同的统计学分析方法,筛选鲫鱼卵母细胞合适的缓冲液、预平衡方法和复温方法,为进一步建立和完善鱼卵细胞玻璃化冷冻的技术路线提供一定的实验依据和技术支持。本研究分为三大部分,首先,在冷冻前比较不同预平衡对鱼卵细胞玻璃化冻存的影响;其次,根据上一部分得出的结论采用合适的预平衡方法后将鱼卵细胞进行玻璃化冷冻,冷冻之后采用双因素分析方法比较不同缓冲液和不同复温方法对鱼卵细胞玻璃化冻存的交互影响;最后,采用单因素分析方法,分别分析不同缓冲液和不同复温方法对鱼卵细胞玻璃化冻存的影响。(1)不同预平衡方法的选择:三步法VS4-K组、三步法VSd-K组显著优于五步法VS4-K组、五步法VSd-K组;三步法VS4-D组、三步法VSd-D组显著优于五步法VS4-D组、五步法VS4-D组。因此,在0℃下以三步法预平衡优于五步法预平衡,每步平衡时间10min更适合鲫鱼卵母细胞的玻璃化冷冻技术。(2)多因素对鱼卵细胞玻璃化冻存的交互影响:不同缓冲液与不同复温方法之间对卵细胞活性不存在交互作用,不同复温方法下,采用不同的缓冲液对鱼卵细胞存活率、SDH活性、MDA含量都不产生显著性影响。(3)不同缓冲液的选择:通过两种缓冲液与两种玻璃化液的交互配制,共有VS4-K、VSd-K、VS4-D、VSd-D四种不同的玻璃化液。对比KCl缓冲液与D-Hank’s缓冲液,VS4-K组卵细胞存活率、SDH活性高于VS4-D组,MDA含量低于VS4-D组;VSd-K组卵细胞存活率、SDH活性高于VSd-D组,MDA含量低于VSd-D组,因此在鱼卵细胞玻璃化冻存中采用KCl缓冲液优于D-Hank’s缓冲液。(3)不同复温方法的选择:玻璃化冻存后的鱼卵细胞分别经过水浴复温和微波复温。两种复温方式中,微波复温组鱼卵细胞存活率、SDH活性均显著高于水浴复温组,MDA含量显著低于水浴复温组,表明微波复温对鱼卵细胞的损伤小于水浴复温,这一实验方法可以应用于鲫鱼卵母细胞玻璃化冷冻。