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鲤春病毒血症（Spring viraemia of carp,SVC）是我国动物疫病名录中的一类动物疫病,一经发现,只能采取全场扑杀、销毁等强制性措施,给渔业经济带来重大损失。现阶段,由于疫苗免疫研究与应用的薄弱和局限,因此养殖过程中进行预防性用药尤为重要。药物研发进程中,基于靶标的精准药物设计可以避免盲目性,由于蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interactions,PPIs）具有高度的专一性,一旦受到外界的干扰或破坏,就可能引起生物体内生物学功能的变化,因此以PPIs为靶标已成为药物研发的热点。诱发SVC的病原是弹状病毒科Sprivivirus属的鲤春病毒血症病毒（Spring viraemia of carp virus,SVCV）,其囊膜表面的糖蛋白（Glycoprotein,G）通过结合不同的宿主因子介导病毒入侵、组装及释放。因此,本研究利用蛋白质互作技术鉴定G蛋白的结合受体,基于G蛋白与受体蛋白相互作用的分子机制,寻找靶向相互作用界面关键氨基酸残基的抑制剂,进一步确定抗SVCV病毒的药物分子,取得以下主要结果:1.G蛋白结合受体的鉴定在细胞水平上,利用转录组测序技术比较分析SVCV感染前后EPC细胞的差异表达基因（DEGs）,发现大部分DEGs被映射到蛋白质结合、DNA结合、受体结合、蛋白激酶活性、受体活性等GO项,并参与抗病毒天然免疫反应和细胞因子介导的信号通路。在鱼体水平上,利用酵母双杂交技术在斑马鱼胚胎文库中筛选与SVCV病毒G蛋白相互作用的受体蛋白,发现阳性候选蛋白具有结合、分子功能调节剂及转录调节活性,并参与翻译、折叠以及运输等通路。经回转验证共获得TCP1、GFAP、ACTB2、RPL24、RPS3等9个与病毒感染过程相关的阳性克隆,SVCV感染EPC细胞48 h后,受体蛋白（GFAP除外）的基因表达水平均呈下调趋势。进一步的CO-IP技术佐证了G蛋白与宿主细胞TCP1蛋白之间存在相互作用,使用过表达技术对TCP1蛋白的功能进行研究,发现过表达的TCP1能够促进SVCV的复制,表明SVCV感染过程中需要利用TCP1蛋白来完成病毒自身的复制。2.G蛋白与TCP1互作模式的探究借助无细胞合成体系、大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞对G蛋白进行外源表达,发现引入Trigger factor标签后可以很好地解决蛋白在大肠杆菌中的溶解性问题,经纯化后获得浓度约为10 mg/m L、纯度大于95%的可溶性融合蛋白。利用紫外-可见光吸收光谱、荧光光谱和圆二色谱对G蛋白二级结构进行鉴定,发现G蛋白在280 nm左右存在吸收峰,说明G蛋白序列含有芳香族氨基酸残基;G蛋白在约338nm处有较强荧光强度,表明G蛋白的荧光主要由色氨酸残基产生;G蛋白在215 nm处有1个代表α螺旋结构的负峰,二级结构主要以α螺旋（97.3%）为主,β转角和无规则卷曲含量分别为2.5%和0.2%。利用SWISS-MODEL、I-TASSER、Phyre~2和Alpha Fold2软件对G蛋白的三维结构进行预测,经模型质量评估发现Alpha Fold2预测得到的模型显示出最高的质量。通过与同源蛋白VSV-G比对,发现G蛋白胞外域可以折叠成4个不同的区域,分别为富含β折叠的顶端横向结构域（残基19～35和328～401）、中央α-螺旋结构域（36～53、277～327和402～423）、颈部PH结构域（54～68和199～276）和茎部融合结构域（69～198）。基于上述结构信息,采用分子动力学模拟方法发现:G蛋白主要通过氢键、疏水作用与TCP1蛋白结合,结合位点位于G蛋白融合结构域的ARG71～HIS80位置;G-TCP1复合物共形成4对氢键,分别为ARG133-GLN634（键长2.92（?））、ARG133-GLN634（3.00（?））、ALA477-TYR631（2.85（?））和GLN478-TYR635（2.70（?））,表明氢键在G蛋白与TCP1的结合中发挥重要作用。3.基于G-TCP1相互作用界面的活性分子发现以EPC细胞为药物筛选模型,通过实时定量PCR技术检测发现32种牛蒡子苷元衍生物显著抑制了G蛋白的基因表达,说明衍生物具有抗SVCV活性。结合实验室前期发现的抗SVCV药物,建立涵盖63种牛蒡子苷元衍生物和49种香豆素类衍生物的抗SVCV活性分子库。以G蛋白与TCP1蛋白互作界面的关键残基（ARG71～HIS80）为对接口袋,利用虚拟筛选技术分别从活性分子库和商业分子库中筛选出12、36、63、92、T1609、T5725（SAB）、T1716和T2727等候选分子,实时定量PCR技术发现其能够有效抑制SVCV复制（抑制率＞80%）。进一步借助光谱学手段发现候选分子通过诱导G蛋白的构象变化,导致蛋白内在荧光规律性淬灭。其中,活性分子SAB对G蛋白的抑制效果最佳,等温滴定量热法确证SAB与G蛋白之间存在自发性放热反应。分子动力学模拟结果发现SAB通过氢键、疏水作用、盐桥及π-π堆积与G蛋白结合,其中氢键作用贡献最大,共形成SAB-LYS65（键长3.10（?））、SAB-THR67（2.90（?））、SAB-THR67（3.22（?））、SAB-TYR73（2.95（?））、SAB-THR79（2.88（?））、SAB-HIE80（2.84（?））、SAB-SER81（2.62（?））和SAB-HIE83（2.80（?））8对氢键。综上所述,本研究鉴定了SVCV病毒G蛋白的关键宿主互作因子TCP1,建立了靶向G-TCP1相互作用界面抑制剂的筛选平台,并利用该平台发现了SAB、T1716和T2727等抗SVCV活性分子。本研究推进了靶向G蛋白与受体蛋白相互作用界面的药物研发进程,以期为水产养殖过程中SVC的防控提供药物保障。