研究背景:乳腺癌是全球女性最常见的癌症,也是女性癌症患者的头号杀手。2019年我国国家癌症中心发布的最新数据报告显示,2015年全国女性乳腺癌新发病例约30.4万,占女性恶性肿瘤发病的17.1%,位居女性癌症发病首位;乳腺癌每年死亡率约为10.50/10万,位居第五,已成为严重威胁我国女性健康的恶性肿瘤之一。乳腺癌是一种高度异质性的肿瘤,对其通常需要进行个体化的综合治疗,包括手术、放射治疗、化学治疗、靶向治疗、内分泌治疗等。由于潜在的有效性和低毒性,从天然产物中提取的植物化学物质也是研究乳腺癌新疗法的来源。重楼是百合科植物云南重楼的干燥根茎,《本草纲目》中认为它有止痛消肿、定惊凉肝、解毒清热之功,因此常用于治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、蛇虫咬伤等症。现代临床肿瘤治疗研究中发现,重楼的单体成分,如重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅳ等,有良好的抑制肿瘤作用。作为重楼的皂苷类主要成分之一,重楼皂苷Ⅲ对于乳腺癌的抗肿瘤功效和作用机制尚未明确。因此,本文对此展开了研究。研究方法:本研究在MCF-7、MDA-MB-231等人乳腺癌细胞系中进行了体外细胞实验,利用CCK8法检测重楼皂苷Ⅲ及其联合柳氮磺吡啶(SAS)对乳腺癌细胞的增殖抑制作用。通过透射电镜观察、GSH和Lipid ROS检测研究铁死亡的发生,并通过Western Blot、流式细胞术、RT-PCR、免疫组化等方法,结合对网络数据库、临床组织样本的分析,对重楼皂苷Ⅲ抗乳腺癌作用及其耐药机制进行了具体研究。本研究还建立了人乳腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为阴性对照组、PPⅢ给药组、SAS给药组和PPⅢ+SAS合用组四个组,每日腹腔注射给药共21天,根据裸鼠体重、裸鼠肿瘤体积、裸鼠肿瘤重量初步评估药物毒性和药效,再结合免疫组化对前两部分的分子机制进行验证。研究结果:1.重楼皂苷Ⅲ能显著抑制乳腺癌细胞的增殖。重楼皂苷Ⅲ对MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖抑制作用主要源于诱导细胞发生铁死亡,且其增殖抑制作用能够被铁死亡抑制剂Ferrostatin-1阻断,而不能被凋亡抑制剂、坏死抑制剂或自噬抑制剂阻断。在细胞周期方面,重楼皂苷Ⅲ能够诱导MCF-7发生浓度梯度依赖的G1周期阻滞,诱导MDA-MB-231乳腺癌细胞发生浓度梯度依赖的G2和S周期阻滞。2.我们发现重楼皂苷Ⅲ在诱导铁死亡的过程中引起铁死亡关键转运蛋白xCT保护性升高从而导致药效降低。联合应用铁死亡诱导剂柳氮磺吡啶(SAS)能够通过下调xCT增强重楼皂苷Ⅲ促进铁死亡的生物学效应,从而增加其对MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖抑制作用。机制上来说,重楼皂苷Ⅲ处理诱导Krüppel样因子4(KLF4)的表达上升,引起xCT蛋白上升从而对抗铁死亡,对肿瘤细胞起到保护性作用。在MCF-7细胞中利用si RNA敲低KLF4后xCT水平下降,铁死亡水平增强从而增强了重楼皂苷Ⅲ的药效,而在MDA-MB-231细胞中利用质粒过表达KLF4后xCT水平出现上升,铁死亡水平降低从而减弱了重楼皂苷Ⅲ的及其与SAS合用的药效。3.通过人乳腺癌裸鼠移植瘤模型的建立,我们对重楼皂苷Ⅲ在体内环境的抗肿瘤作用进行了研究。结果表明,重楼皂苷Ⅲ减慢了裸鼠体内的肿瘤生长速度,且联合应用SAS后使得重楼皂苷Ⅲ的药效更强,重楼皂苷Ⅲ和SAS对裸鼠均不产生明显毒性。对裸鼠肿瘤组织进行的免疫组化结果显示,相比于阴性对照组,重楼皂苷Ⅲ处理后肿瘤细胞内的KLF4和xCT表达水平和细胞内脂质过氧化水平出现显著上升;而联合应用SAS能够逆转KLF4和xCT的表达上调,进一步增强细胞内的脂质过氧化水平。结论:重楼皂苷Ⅲ作用于乳腺癌细胞引起细胞周期阻滞并抑制细胞增殖,它的增殖抑制作用主要源于诱导细胞发生铁死亡。重楼皂苷Ⅲ作用于乳腺癌细胞会通过上调KLF4引起铁死亡重要转运蛋白xCT的保护性升高,导致肿瘤细胞耐药;合用铁死亡诱导剂SAS或敲低KLF4能显著增强重楼皂苷Ⅲ的抗乳腺癌作用。