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背景为了改善头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinomas,HNSCC)的治疗效果,迫切需要找到与HNSCC复发、转移和耐药相关的生物标记物。常规实验方法受限于只能研究单个或一组基因的表达而无法全面的解释肿瘤生物学行为。基因表达微阵列芯片技术可以提供细胞或组织几乎所有转录活性的表达情况,目前该技术已被广泛应用于肿瘤诊断、疾病分析、药物研发和药物毒性等领域。基因并不是单独作用而是在多个错综复杂的反应网络中与其他基因共同调节生物学功能。尽管基因表达微阵列芯片所得数据庞大,但数据本身并不能直接体现生物学功能差异。为了充分发掘基因表达微阵列芯片数据的意义,我们引入基于云计算的独创性通路分析软件分析基因表达差异与癌症的关系。本研究小组使用肝细胞生长因子模拟HNSCC肿瘤微环境,发现肿瘤细胞迁徙和侵袭能力增强,并检测到BAG-1蛋白表达增高,因而提出BAG-1可能与HNSCC的顺铂耐药性相关的假设。本研究使用基因表达微阵列芯片技术结合常规实验技术证明BAG-1过表达与HNSCC的顺铂耐药相关。实验方法(1)细胞的选择:MTT法检测顺铂对7对HNSCC细胞活性的影响,这7对细胞是由美国密歇根大学提供、取材自7名HNSCC患者的原发性(A组)及其复发/转移后肿瘤组织(B组)而建立的细胞系;克隆形成实验检测细胞使用顺铂孵育后克隆形成差异;Western Blot检测耐药细胞与其对应原发性细胞Cleaved Caspase 3和9的表达。(2)HGF对HNSCC细胞表型的影响:基质金属蛋白酶检测HGF、HGF联合肿瘤信号通路抑制剂(MEK1/2抑制剂或PI3K抑制剂)对肿瘤细胞迁徙能力影响;侵袭小室实验观察HGF刺激后HNSCC细胞侵袭能力变化;Western Blot检测HGF、HGF联合肿瘤信号抑制剂对BAG-1表达的影响。(3)基因表达微阵列芯片分析:7对细胞中的复发/转移后细胞(B组)与原发性细胞(A组)进行对比;使用前述实验确认的顺铂耐药细胞14B(复发)、17B(转移)与其对应的原发性细胞14A、17A进行对比;IPA分析基因表达差异与癌症病情进展的关系。(4)BAG-1与BCL-xL表达:应用Western Blot法检测14A和14B、17A和17B细胞中BAG-1、BCL-xL和磷酸化AKT表达差异;免疫组织化学方法检测上述三种蛋白在组织芯片中的表达。(5)顺铂耐药性检测:通过血清饥饿实验和DNA Ladder实验再次检测14A和14B细胞对环境和顺铂反应的差异;Western Blot法检测顺铂孵育24 h后14A和14B细胞BAG-1、BCL-xL和凋亡相关蛋白的表达。(6)BAG-1与肿瘤信号通路:Western Blot法检测不同浓度顺铂孵育24 h后14A和14B细胞肿瘤信号通路相关蛋白磷酸化水平;肿瘤信号通路抑制剂孵育14B细胞后检测BAG-1的表达水平变化;MTT法检测顺铂联合肿瘤信号通路抑制剂对14B细胞活性影响;BAG-1 siRNA孵育14B细胞后检测BAG-1和肿瘤信号通路磷酸化蛋白表达水平变化;MTT法检测BAG-1 siRNA干扰后的14B细胞对顺铂的反应。实验结果(1)顺铂对HNSCC肿瘤细胞活性和集落形成的抑制有剂量依赖性,细胞中14B和17B细胞顺铂耐药性明显高于其对应14A和17A细胞;Cleaved Capspase 3和9表达水平较同浓度顺铂孵育的原发细胞14A和17A低。(2)HGF孵育后肿瘤细胞转移、侵袭能力增强;BAG-1M蛋白表达增高;HGF诱导BAG-1表达增高的作用可被MEK1/2抑制剂或PI3K抑制剂拮抗。(3)HNSCC肿瘤细胞形态相似,但基因表达差异明显;HNSCC发病机制可能与性别相关因素有关;得到一系列包括E2F3、MTOR、DEK在内的与癌症复发/转移相关的上游调控因子;14B和17B细胞BAG-1和BCL2L1(BCL-xL蛋白编码基因)等基因表达较14A和17A细胞增高,并得到包括IFG-γ、催乳素和肝细胞生长因子在内的一系列上游调控因子可能与BAG-1表达水平和顺铂耐药性升高有关。(4)14B和17B细胞BAG-1、BCL-xL和磷酸化AKT表达水平较对应14A和17B细胞高,其中BAG-1三种蛋白异构体在14和17组表达不同,14A细胞未检测到BCL-xL和磷酸化AKT;60例HNSCC组织芯片中仅2例BAG-1表达阳性,并且BCL-xL和磷酸化AKT表达在这两例表达也呈阳性。(5)14B细胞对低营养环境或顺铂耐受能力较14A细胞高;顺铂孵育24 h后14B细胞BAG-1表达仍比14A细胞高,BCL-2和BCL-xL也有类似现象,但在所有浓度孵育下14A和最高浓度孵育下的14B未检测到BCL-2表达;DNA损伤标记蛋白磷酸化γH2AX表达在14B细胞中较14A细胞低。(6)同浓度顺铂孵育24 h后14B细胞磷酸化的ERK、AKT、STAT维持高水平,而在14A细胞表达水平显著降低;PI3K或STAT3抑制剂可使BAG-1蛋白表达降低,但BAG-1蛋白三种异构体变化程度不同,MEK1/2抑制剂未检测到BAG-1表达变化;顺铂联合PI3K或MEK1/2抑制剂孵育14B细胞,细胞活性下降幅度大于单独使用顺铂,顺铂联合STAT3抑制剂有一定的抑制效果但低于顺铂联合PI3K或MEK1/2抑制剂;BAG-1 siRNA干扰14B细胞后磷酸化ERK、AKT和STAT表达降低,降低其对顺铂耐药性。结论顺铂可抑制HNSCC细胞的活性并诱导细胞凋亡,但某些肿瘤细胞对顺铂耐药;HNSCC有多种亚型,患者病情进展与肿瘤微环境产生的中的多种因子有关;BAG-1在部分顺铂耐药细胞中表达上调,其作用机制与BCL-xL、PI3K/AKT、MAPK/ERK和JAK/STAT信号通路密切相关。