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目的:本实验使用姜黄素处理人食管癌Eca-109细胞,CCK-8法检测姜黄素对Eca-109细胞的抑制作用、流式细胞技术检测早期凋亡率和细胞周期、琼脂糖凝胶技术检测有无Ladder状条带形成,电镜技术观察细胞超微结构,免疫细胞化学技术等检测几种凋亡相关蛋白的表达情况。通过使用上述研究手段,多角度、全方位的观察姜黄素对Eca-109细胞的杀伤作用及其可能的机制。
方法:
1.CCK-8法检测不同浓度姜黄素(20,40,80μmol·L-1)、不同时间点(12h,24h,48h,72h)作用于Eca-109细胞的增殖抑制率。
2.应用Caspase3活性检测试剂盒对Eca-109细胞用药前后Caspase3活性进行检测分析。
3.流式细胞技术检测姜黄素作用于Eca-109细胞24h后的细胞周期变化及凋亡率情况。
4.琼脂糖凝胶电泳技术检测姜黄素干预Eca-109细胞24h后,寡核苷酸片段(DNA ladder)的形成。
5.收集姜黄素作用后的Eca-109细胞,制备超薄切片,透射电镜观察Eca-109细胞超微结构的改变。
6.采用Hoechst33258染色试剂盒对Eca-109细胞用药前后,细胞的凋亡情况进行检测分析。
7.免疫细胞化学技术检测凋亡相关基因Bax和Bcl-2的表达情况。
结果:
1.CCK-8结果显示:体外培养的食管癌Eca-109细胞中加入不同浓度的姜黄素(20、40、80μmol·L-1),分别培养12h、24h、48和72h,各组生长抑制率有明显增高,且呈剂量浓度依赖性,组间差异有显著性(P＜0.01)。
2.Caspase3活性检测发现:20μmol·L-1姜黄素作用24h后OD值为0.323;40μmol·L-1姜黄素作用24h后为0.476,与对照组比较,后二组OD值分别增高2.09倍和3.09倍,差异具有统计学意义(P＜0.05).
3.流式细胞术检测发现,姜黄素作用后,Eca-109细胞凋亡率明显升高,与阴性对照组比较差别有统计学意义(P＜0.05),且呈剂量相关性。姜黄素抑制了Eca-109细胞的增殖,其细胞周期在G2/M期受到阻滞。
4.琼脂糖凝胶电泳结果显示,经姜黄素处理过后的Eca-109细胞DNA,电泳时出现明显的Ladder状条带,提示姜黄素可诱导Eca-109细胞凋亡。
5.电镜观察Eca-109细胞超微结构发现,加入姜黄素作用于癌细胞后,细胞结构发生显著改变。可见线粒体、溶酶体及内质网等细胞器减少或消失,细胞核异染色质增多;染色质分布不均成团块状,凝集在核膜下,为致密的半月形团块;可见核固缩、核畸形或核碎裂,凋亡小体形成等改变,其作用强度随药物作用时间和浓度的增加而增强。
6.Hoechst33258染色可见,经20μmol·L-1姜黄素作用12h后未见明显凋亡细胞;随着药物作用时间的延长及药物浓度的增加,发生凋亡的细胞显著增加。40μmnol·L-1姜黄素作用48h后,可见有较多细胞发生凋亡。
7.免疫细胞化学染色显示,随着姜黄素浓度的增高和作用时间的增长,抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达减弱,促凋亡基因Bax蛋白表达增强。
结论:
姜黄素抑制食管癌Eca-109细胞增殖并诱导其凋亡,机制可能与破坏细胞超微结构、阻滞其细胞周期G2/M期、上调促凋亡基因Bax的表达,同时下调凋亡抑制基因Bcl-2表达等有关。