论文部分内容阅读
本论文共分五部分，内容如下：
第一部分，目的：克隆人组织纤溶酶原激活物(tPA)基因并构建携带tPA基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)/tPA，并研究其有无生物学活性。
方法：用RT-PCR法从人心脏组织中克隆tPA基因并将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，对pcDNA3.1(+)/tPA进行酶切鉴定和测序。脂质体介导pcDNA3.1(+)/tPA转染血管平滑肌细胞(VSMC)，分别用NothernBlot和斑点印迹法从mRNA和蛋白质水平检测tPA的表达，并用纤维蛋白板法测定表达产物的生物学活性。
结果：成功地克隆了人tPA基因并构建了pcDNA3.1(+)/tPA真核表达质粒，测序结果显示克隆的全长t-PA基因片段与基因文库报告一致；pcDNA3.1(+)/tPA转染VSMC后，tPAmRNA和蛋白质表达增加，所表达的tPA蛋白质具有纤溶活性。
结论：含t-PA基因新型真核表达质粒构建成功，让其转染VSMC后其表达蛋白质具有纤溶活性，为利用基因防治移植心脏血管狭窄底实验研究奠定了基础。
第二部分，目的：构建人VEGF165基因的真核表达质粒pBudCE4.1/VEGF165，观察其在血管内皮细胞(VEC)中的表达和表达产物对VEC增殖的影响。
方法：用RT-PCR法从引产胎儿心脏组织中克隆VEGF165基因，并将其克隆至真核表达质粒pBudCE4.1中，对重组真核表达质粒pBudCE4.1/VEGF165进行酶切鉴定和测序。以脂质体转染法将pBudCE4.1/VEGF165导入VEC中，Northernblot和免疫细胞化学染色法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测它们在转染的VEC中的表达，并检测表达产物对VEC增殖的影响。
结果：人VEGF165基因的RT-PCR产物为576bp。测序结果显示，扩增的VEGF165基因的序列与基因文库中登录的序列完全一致。经HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定证实，VEGF165基因已成功地克隆至真核表达质粒pBudCE4.1中。以其转染血管平滑肌细胞(VSMC)后，经Northernblot杂交和免疫细胞化学染色法检测均证实VEGF165基因表达。表达产物对VEC增殖有明显的促进作用。
结论：所构建的pBudCE4.1/VEGF165真核表达质粒可在VEC中表达，表达产物可明显促进VEC增殖，为通过VEGF165基因转染防治移植器官内血管的狭窄奠定了基础。
第三部分，目的：构建携带人组织纤溶酶原激活物(tPA)和血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因的真核表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165，并观察其在内皮细胞(VEC)中的表达。
方法：将tPA和VEGF165基因克隆至真核表达质粒pBudCE4.1中，构建共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165。将pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染VEC，用RT-PCR法和Westernblot法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测被转染的VEC中的tPA和VEGF165表达。
结果：人tPA和VEGF165基因的RT-PCR产物分别为1.9kb和576bp。经酶切鉴定证实，tPA和VEGF165基因已克隆至真核表达质粒pBudCE4.1中。以其转染VEC后，经RT-PCR法和Westernblot检测发现，tPA和VEGF165在mRNA和蛋白质水平均有表达。
结论：成功地构建了真核表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165，并在VEC中表达tPA和VEGF165，为tPA和VEGF165基因转染防治移植器官内血管狭窄奠定了基础。
第四部分，目的：观察组织纤溶酶原激活物(tPA)和血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)基因共表达质粒在血管平滑肌细胞(VSMC)中的表达，并研究表达产物对血管内皮细胞(VEC)和VSMC增殖的影响和纤溶作用。
方法：用脂质体转染法将tPA和VEGF165的共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165导入VSMC中，逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)分别从mRNA水平和蛋白质水平检测tPA和VEGF165的表达；纤溶蛋白板法检测转染基因的VSMC培养基中tPA的纤溶活性；取转染pBudCE4.1/tPA-VEGF165的VSMC培养基培养VEC和VSMC，用四甲基偶氮唑盐(MTT)和流式细胞技术检测转基因VSMC的细胞培养基对VEC和VSMC增殖的影响。
结果：pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染VSMC后，RT-PCR和ELISA检测发现，tPA和VEGF165在mRNA和蛋白质水平均有表达；转基因培养基有明显促进纤溶和促VEC增殖作用，而对VSMC增殖无作用。
结论：tPA和VEGF165基因共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165能在VSMC表达有生物学活性的tPA和VEGF165，为tPA和VEGF165基因转染防治移植心脏内血管狭窄奠定了基础。
第五部分，目的：观察联合转染组织纤溶酶原激活物(tPA)和血管内皮生长因子165(VEGF165)基因对小鼠移植心脏内血管狭窄的影响并探讨可能机制。
方法：C57BL/6小鼠作为移植供体，Balb/c小鼠作为移植受体，利用显微外科技术建立小鼠心脏移植模型。用微注射方法，将携带有tPA和VEGF165基因的真核表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165灌注小鼠移植心脏血管。实验分为3个组：A组(生理盐水转染组)；B组(空载质粒pBudCE4.1转染组)；C组(携带有tPA和VEGF165基因的pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染组)。按实验终点(术后1d、3d、7w、14d和28d)分为5个亚组。每个实验终点取移植心脏用于病理学检测、电镜观察、RT-PCR和Western印迹检查。
结果：术后各时间点基因转染组移植心脏tPA和VEGF165基因的mRNA和蛋白质表达量明显高于对照组(P＜0.01)。与对照组比较，术后各时间点基因转染组移植心脏血管内膜面积和狭窄率均显著减小(P＜0.01)，术后28d时基因转染组管腔狭窄率比对照组降低了59.0％。
结论：联合转染VEGF165和tPA基因可抑制小鼠移植心脏血管狭窄的发生。