USP22在小鼠肝脏部分切除后的变化及作用机制探究

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目的:探讨泛素特异性蛋白酶22(ubiquitin specific peptidase 22,USP22)在小鼠肝脏部分切除后的变化趋势,并探索在肝再生中与Wnt信号通路的关系及作用机制,为以后在临床上的研究开发提供一定的理论基础。方法:实验组采用经典的Higgins和Anderson法建立70%肝切除模型建立后,在各取材时间点,经下腔静脉取血离心1后取血清进行生化分析,丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。各组小鼠处死后,根据残肝叶的再生肝重,计算残肝再生率。使用免疫组织化学法检测Ki67标记指数,Ki67的阳性表达为细胞核呈棕黄色颗粒染色,在40×高倍镜下选取均匀的染色视野10个,采用半定量记分法判定结果。蛋白质提取:采用RIPA裂解液提取组织总蛋白,BCA法进行蛋白定量。Western blot检测:SDS-PAGE电泳转至PVDF膜上,最后在暗室胶片曝光显影;结果以USP22/β-actin灰度值表示目的因子蛋白的相对表达量。RNA提取:采用Trizol提取总RNA后逆转录,得到总c DNA。RT-PCR检测:以逆转录得到的c DNA为模板按照比例配置反应体系,进行目的基因的扩增,每个标本重复3次。使用SDS1.1软件分析结果。统计学分析:采用SPSS18.0统计软件分析处理结果,用均数±标准差表示计量资料,使用t检验比较在不同组间目的因子的表达水平。结果:1.小鼠PH术后肝再生率升高主要在术后24h以后,最终小鼠肝脏再生率可稳定达70%以上。术后血清检测小鼠肝功能转氨酶指标变化显示,ALT和AST均显著升高,6h——24h出现高峰期,随后快速下降,直至对照组水平;呈现一过性升高趋势。2.PH术后免疫组化检测结果表明,Ki-67阳性细胞数在术后12h开始有所增加,48h和96h达到高峰,其后阳性细胞数逐渐减少,差异有统计学意义(p<0.01)。3.PH术后USP22蛋白的Western Blot结果显示,术后USP22蛋白质表达水平急剧降低,随后蛋白表达水平随着术后时间的延长逐渐提高,差异有统计学意义(p<0.01)。4.再生肝脏USP22、β-Catenin及Cyclin D1的m RNA表达:小鼠肝脏切除后不同时间点的RT-PCR测定结果显示,与对照组相比,Cyclin D1的m RNA表达水平术后表达增高,48h出现峰值,随后逐渐下降至正常值水平。β-Catenin的基因表达在术后也有所降低,24h后表达水平开始升高,到96h出现高峰;USP22的表达与之相似,不同点在于至48h表达水平才有所升高,差异有统计学意义(p<0.01)。结论:PH术后USP22的蛋白表达先降低后升高。而且USP22与β-Catenin的m RNA表达紧密相关,这说明在肝再生过程中,USP22与Wnt/β-catenin通路存在密切联系。
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