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石斑鱼是我国以及东南亚地区重要的海水养殖经济鱼类。近年来由于养殖密度的不断提高，海水养殖环境的不断恶化，使得养殖石斑鱼病害频发，对石斑鱼的养殖业造成了严重的危害。其中新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singaporegrouperiridovirus，SGIV)就是一种具有强致病性的海水鱼类病毒，可导致石斑鱼死亡率达90％以上。目前对于石斑鱼免疫系统特别是在病毒感染中石斑鱼的免疫应答机制，以及宿主与病毒间相互作用还缺乏深入的了解。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是真核生物体内一类重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过磷酸化介导细胞外刺激信号到细胞核的转导，引起细胞生物学反应，在细胞应激反应中发挥着重要作用。MAPK主要有五个成员:细胞外信号调节激酶(ERK)，C-JunN-端或应激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)，ERK5/大MAP激酶1(BMK1)和p38MAPK。越来越多研究表明许多哺乳动物病毒感染能激活MAPK，并且MAPK在病毒的增殖中发挥着重要的作用。鉴于实验室前期研究表明，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号分子包括ERK，JNK以及p38MAPK参与了病毒感染。因此，本论文对斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)p38MAPK信号分子及其调节的转录因子-脂多糖诱导肿瘤坏死因子(LITAF)进行了克隆与功能分析，取得了如下创新性研究成果:
1、通过RACE技术克隆获得石斑鱼p38MAPK的三种亚型(p38a、p38b和p38β，以下简称:Ec-p38a、Ec-p38b以及Ec-p38β)全长cDNA。三个基因全长分别为1787bp、1589bp、1358bp，均编码361个氨基酸。同源性搜索结果显示Ec-p38a、Ec-p38b分别与大西洋鲑的p38a、p38b具有97％以及91％的同源性;而Ec-p38β则与斑马鱼的p38β有91％的相似度。氨基酸序列比对结果显示，三者均具有p38MAPK家族保守的“TGY”结构域和“ATRW”底物结合位点。石斑鱼p38的三种亚型呈泛组织分布，且在鱼类主要免疫组织中都有较高的表达量。体外免疫荧光亚细胞定位结果显示三种亚型在石斑鱼脾细胞(GS)中均为全细胞分布。对SGIV感染石斑鱼后三者在头肾中的表达量进行荧光定量PCR分析，结果显示病毒感染后，Ec-p38MAPK三种亚型在头肾中表达量均有不同程度的升高，其中Ec-p38β表达上调较为明显，说明Ec-p38β在SGIV的感染中发挥了相对重要的作用。因此选择Ec-p38β展开进一步的功能研究。通过筛选过量表达Ec-p38β的FHM细胞，并进行病毒感染试验，我们发现过表达Ec-p38β能延迟SGIV感染FHM细胞引起的细胞病理变化，并能抑制SGIV诱导的细胞凋亡。通过免疫印迹和RT-PCR检测发现，SGIV的结构蛋白基因，包括主要衣壳蛋白VP72和囊膜蛋白VP16的转录和蛋白合成都得到了显著的抑制。由此我们推测石斑鱼p38MAPK对病毒在宿主细胞内的复制以及病毒诱导的细胞死亡有非常重要的作用。
2、通过RACE技术从石斑鱼脾组织获得了Ec-LITAFcDNA，该基因编码141aa的多肽，与裸盖鱼LITAF具有74％的同源性，而与石斑鱼虹彩病毒SGIV编码的LITAF(vLITAF)具有27％的同源性。氨基酸序列比对结果表明，Ec-LITAF具有LITAF家族典型的LITAF结构域，该结构域中包含了两个“CXXC”基序及八个保守的半胱氨酸残基。进化发育分析表明，Ec-LITAF与鱼类的LITAF聚在一支，且与裸盖鱼、大西洋鲑、斑马鱼以及虹鳟的进化距离较近。对Ec-LITAF在石斑鱼各组织中的表达分析揭示，Ec-LITAF在所有组织中均有表达，而在鱼体脾脏、肾脏、头肾和皮肤等免疫相关组织或器官中表达量较高。荧光定量PCR分析表明，在SGIV感染鱼体后，Ec-LITAF表达量升高，但是在随后的感染时间点的变化趋势不相同。Ec-LITAF在感染石斑鱼脾组织细胞EAGS后，随着感染时间的延长，逐渐降低。有意思的是，SGIV病毒编码的vLITAF随着感染时间的延长表达量却逐渐增加。而体外转染试验揭示，vLITAF的表达能够下调石斑鱼细胞EAGS中Ec-LITAF的表达，并且Ec-LITAF的体外表达能上调石斑鱼细胞因子-肿瘤坏死因子TNF(包括TNF1和TNF2)以及其受体TNFR基因(包括TNFR1和TNFR2)的表达，由此我们推测SGIV可能通过自身编码的vLITAF调节宿主石斑鱼Ec-LITAF的表达，从而影响宿主由TNF启动的免疫反应。此外，荧光显微镜观察结果显示，Ec-LITAF主要分布在细胞质中，且与SGIV编码的vLITAF完全共定位，进一步为两者可能存在相互作用提供了证据。进一步选用p38特异性抑制剂处理SGIV感染的EAGS细胞，我们发现抑制p38MAPK的活性明显下调了病毒感染诱导的Ec-LITAF表达，表明p38MAPK调节了病毒感染后Ec-LITAF的表达，对于两者之间具体的相互作用机制还有待于进一步研究。
以上研究结果表明石斑鱼p38MAPK分子及其介导的LITAF调控系统在宿主抵御SGIV感染的免疫反应中发挥了重要的作用，这有助于阐明鱼类虹彩病毒感染及宿主与病毒相互作用的分子机制，为石斑鱼病害的防治提供了新的策略和理论依据。