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支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是新生儿时期慢性肺部疾病的主要形式，其主要病理特征为肺泡发育障碍，肺泡增大、数目减少，并伴有不同程度的肺间质纤维化。BPD常发生于孕30周前出生的早产儿，出生时肺部发育尚处于囊泡期，仅出现原始肺泡，肺部所处环境发生变化，使其肺泡发育的信号被干扰或阻断，具体机制不明。资料显示，大部分早于30周分娩的产妇中患有绒膜羊膜炎，致使胎肺在宫内暴露于炎性环境中。由于肺部发育尚不成熟，出生后早产儿往往需要长期高浓度用氧和辅助通气，而临床和动物实验证明高氧和机械辅助通气均可分别引起肺部炎性因子的高表达以及炎性细胞的聚集。多项临床研究表明BPD患儿气道中促炎因子表达水平持续升高，肺部炎性细胞大量聚集。可以认为:炎症是BPD发生的重要因素之一，但是对于BPD发生过程中的炎性机制目前尚无深入研究。 SB256510是中性粒细胞趋化因子受体CXCR2的特异性拮抗剂，能够有效抑制中性粒细胞的趋化作用，并且促进活化中性粒细胞的凋亡。本课题利用SB256510抑制中性粒细胞肺内聚集，探讨中性粒细胞在高氧暴露导致BPD过程中的作用和机制，为特异性抗炎治疗提供理论依据和实践方法。 一、中性粒细胞在高氧肺损伤导致新生大鼠BPD发生中的作用和机制 （一）高氧暴露新生大鼠BPD模型的建立及SB256510干预方法 定期受孕的Sprague Dawley大鼠，在分娩当日分别置于高氧舱和空气舱内，每只大鼠平均产仔12只，新生大鼠随机分为: Ⅰ空气对照组; Ⅱ空气+SB256510干预组; Ⅲ高氧实验组; Ⅳ高氧+ SB256510干预组 应用MaxO2氧浓度检测仪监测高氧舱.中氧气浓度，保持氧浓度为60％。从出生第3天到第10天，Ⅱ和Ⅳ组新生鼠每天1次皮下注射SB2565104mg/kg（体积4ml/g体重），Ⅰ和Ⅲ组每天皮下注射相同体积的PBS作为对照。 与空气舱中两组新生大鼠相比，高氧舱中两组的存活率均明显下降，（P＜0.05），而肺湿/干重比则升高(P＜0.05)，表明高氧可使新生大鼠肺部血管通透性增高，出现肺水肿。高氧+SB256510干预组存活率较高氧实验组略有升高，肺湿/干重比略有降低，但二者差异无统计学意义。 （二）肺内中性粒细胞及相关趋化因子的检测 1、支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白浓度和细胞分类计数 分别于暴露后第7d和14d，腹腔注射20％乌拉坦麻醉，气管切开并插管，用0.8ml预冷的生理盐水进行支气管肺泡灌洗，重复4次，合并灌洗液(BALF)，离心，用考马氏亮蓝染液检测上清中的蛋白浓度，沉淀用1ml PBS重悬后取0.1ml在光镜下进行细胞计数，细胞涂片进行瑞氏染色，分类计数。结果表明，暴露7d，高氧实验组新生大鼠BALF中蛋白含量、白细胞总数和中性粒细胞比例均较空气对照组明显升高(P＜0.05);相应经SB256510干预组上述各值显著降低(P＜0.05);高氧实验组新生大鼠在14d时BALF中细胞总数和中性粒细胞比例较7d时有所减少(P＜0.05）。 2、肺组织中性粒细胞趋化因子CINC-1的表达 利用抗CINC-1单克隆抗体为一抗对各组肺组织标本进行免疫组化染色检测CINC-1的表达，实验结果显示，高氧实验组支气管和肺泡上皮细胞中CINC-1呈强阳性表达，相应SB256510干预组CINC-1表达减少;空气对照组仅在支气管上皮细胞中呈弱阳性表达，相应SB256510干预组CINC-1表达无明显变化。 3、肺组织中性粒细胞的聚集 利用抗MPO多抗为一抗对各组肺组织标本进行免疫组化染色检测肺组织中性粒细胞，实验结果显示，高氧实验组肺间质中可见大量中性粒细胞聚集，相应SB256510干预组肺内中性粒细胞聚集明显减少，甚至未见有中性粒细胞浸润。空气对照组和空气+ SB256510干预组新生大鼠肺内可见极少中性粒细胞浸润。 以上结果表明，高氧暴露可使新生大鼠肺组织中性粒细胞相关趋化因子表达水平上升，导致中性粒细胞大量聚集;SB256510可有效地干预中性粒细胞的趋化作用，阻止其肺内聚集。 （三）肺组织氧/氮自由基检测 1、肺组织羟自由基检测 由于羟自由基极不稳定，利用羟自由基与水杨酸钠结合可生成较稳定的2，3-二羟基苯甲酸(2，3-DHBA)和2，5-二羟基苯甲酸(2，5-DHBA)，采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定羟自由基与水杨酸钠结合产物2，3-二羟基苯甲酸(2，3-DHBA)和2，5-二羟基苯甲酸(2，5-DHBA)的含量，可反映羟自由基的产生水平。实验结果表明，高氧暴露7d和14d肺羟自由基较空气对照组明显升高（P＜0.05），相应SB256510干预组羟自由基的产生显著减少(P＜0.05）。 2、脂质过氧化检测 肺匀浆上清中加入等体积15％NaOH(w/v)，40℃水浴1h，样品经Sep Pak C18柱(Waters)进行固相纯化处理后，采用EIA试剂盒(Cayman)进行定量测定脂质过氧化产物F2-异前列腺烷含量，实验结果表明，高氧暴露新生大鼠肺组织中F2-异前列腺烷水平在7d(P＜0.01)和14d(P＜0.05)时显著高于空气对照组;高氧+SB256510干预组8-异前列腺烷水平较高氧实验组显著降低(P＜0.05），但仍高于空气对照组。 3.硝基化蛋白质检测 氮自由基可使蛋白质酪氨酸硝基化，以兔抗硝基酪氨酸的多克隆抗体为一抗，采用免疫组化和Western blot检测肺内硝基酪氨酸产生及分布。免疫组化结果显示空气暴露新生大鼠肺部未见明显硝基化酪氨酸形成，高氧实验组在7d和14d时硝基化酪氨酸显著增加，在肺泡和肺大气道上皮细胞、肺间质均有分布，高氧+SB256510干预组大鼠肺内硝基化酪氨酸形成明显减少。 高氧实验组新生大鼠肺组织匀浆在Western blot中至少有8个条带显示，提示有多种蛋白质的酪氨酸被硝基化，高氧+ SB256510干预组相应条带密度减小，提示肺内蛋白硝基化酪氨酸形成减少。 以上结果表明，高氧暴露可导致新生大鼠肺组织大量产生羟自由基、F2-异前列腺烷和硝基化蛋白质，抑制中性粒细胞趋化可减少上述氧/氮自由基衍生物的生成。 二、CXCR2反义质粒的构建、表达及其对CXCR2表达的影响 （一）CXCR2反义质粒的构建及其对体外培养细胞CXCR2表达的影响 1、反义重组质粒pcDNA-hu-CXCR2的构建 酚:氯仿法提取人外周血白细胞基因组DNA，以基因组DNA为模板PCR扩增CXCR2基因的部分片段，将扩增片段反向连接于pcDNA3.1质粒中，得到反义RNA重组质粒pcDNA-hu-CXCR2。 2、反义质粒pcDNA-hu-CXCR2对HL60细胞CXCR2表达的影响 电穿孔介导pcDNA-hu-CXCR2转染HL60细胞，在转染72小时后进行G418抗性细胞筛选，3周左右在96孔板中筛选稳定转染细胞克隆。利用RT-PCR和免疫组化检测CXCR2的表达。 RT-PCR检测结果表明，稳定转染细胞株CXCR2mRNA转录水平较未转染细胞降低70％。 免疫组化检测:利用抗人CXCR2单克隆抗体为一抗，对细胞涂片行免疫组化染色，结果显示未转染细胞膜上有CXCR2蛋白表达，而抗G418的HL60细胞未见染色阳性染色。 （二）脂质体包裹的外源质粒在新生大鼠肺内的分布与表达 pRSV-LacZ质粒以1∶2(w/v)比例包裹DMRIE-C脂质体，出生后1天的新生大鼠腹腔注射质粒（2ug/g体重）。在不同时间点取肺组织，冰冻切片行X-gal原位染色。结果表明注射24h后，肺组织约有5％的区域蓝染，为LacZ基因表达区域，12h、48h未见蓝染区域。 三、结论 一、本实验结果显示高氧暴露组新生大鼠肺泡发育受阻，肺间质局灶性纤维化，可以重现人类BPD的肺部病理变化，并可以作为支气管肺发育不良的炎性(BPD)研究模型。 二、新生大鼠高氧暴露时，肺组织中性粒细胞大量聚集，肺组织中氧/氮自由基衍生物水平显著升高，进一步证实了中性粒细胞的聚集以及肺组织中氧/氮自由基衍生物的过量形成是BBD发生的重要因素，并首次通过SB256510途径干预中性粒细胞趋化作用，从而可以明显减少肺组织中氧/氮自由基衍生物的产生，为其防治提供了理论依据。 三、新生大鼠高氧暴露时，首次通过SB256510途径干预中性粒细胞趋化作用，可以在一定程度上逆转肺泡发育停滞以及肺间质局灶性纤维化现象，为特异性抗炎预防和治疗BPD提供理论依据和实践方法。 四、成功构建了CXCR2反义质粒，通过体外细胞培养试验证明可以有效地抑制HL60细胞CXCR2的表达。 五、腹腔注射的DMRIE-C脂质体包裹外源质粒DNA24小时后在新生大鼠肺组织局部可见表达，为其进一步用于抗炎症治疗奠定了基础。