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概述恶性肿瘤是当今严重威胁人类生命的疾病,目前肿瘤治疗的主要手段有手术、放疗、化疗和生物治疗,放疗是一种主要的非手术治疗方法,约有70%的患者在其病程的某一阶段需要接受放疗。因此,提高放疗疗效对提高肿瘤的临床疗效非常重要。提高放疗疗效主要可以从放射治疗学的两个大方面着手:放射物理和放射生物。提高肿瘤的放射敏感性是放射生物的一个主要研究方向,由此,放射增敏剂的研究应运而生。放射增敏剂定义为某种化学物质或生物制剂,当它们与放射线合并使用时,可以增强放射线对肿瘤的杀伤的作用。顺铂是临床常见的具有放射增敏作用的抗肿瘤药物,但由于其到体内迅速与血浆蛋白结合而限制了放射增敏作用的发挥。顺铂的缓释制剂有望延长药物的作用时间,增加疗效,并降低毒性,本研究自制纳米级脂质体包裹的顺铂(nanoliposomal cisplatin,NLDDP),观察其在小鼠体内的药物动力学过程,研究其体外和体内的抗肿瘤作用及与放射联合时的放射增敏作用,以为肿瘤的治疗找到一种更为有效的放射增敏剂提供实验基础。目的观察NLDDP在小鼠体内的药物动力学过程;研究NLDDP在体外对肿瘤细胞的活性抑制,观察其联合照射对肿瘤细胞体外生存的影响;在Lewis肺癌和B16黑色素瘤移植瘤小鼠模型中探讨NLDDP与放射治疗联合时的在体抗肿瘤作用及放射增效价值;在Lewis肺癌移植瘤小鼠模型中探讨NLDDP与放射联合时的放射生物学效应。材料与方法1.通过逆向蒸发法制备NLDDP,检测照射后不同时间药物的药物体外释放率。体内药物动力学实验选用C57BL/6N近交系Lewis肺癌荷瘤小鼠,分成两组,尾静脉分别注射普通顺铂(CDDP)和LDDP,剂量均为6 mg/kg。于注射后不同时间取血并处死动物,取肿瘤、肾、肝和肺组织。采用高效液相色谱法(HPLC)测定游离铂的含量,石墨炉原子吸收光谱法测定肿瘤及正常组织中总铂的含量。2.选用人肺癌A549细胞系,通过MTT分析法检测单纯脂质体、NLDDP和CDDP对细胞的半数抑制浓度(IC50);通过细胞集落形成观察NLDDP与放射联合对肿瘤细胞生长的影响。3.选用6～7周龄C57 BL/6N近交系小鼠,分别接种Lewis肺癌和B16黑色素瘤。小鼠尾静脉分别注射NLDDP和CDDP,6mg/kg,用药后1、24、72小时进行肿瘤局部不同剂量照射,观察肿瘤生长延迟情况;Lewis肺癌荷瘤小鼠尾静脉分别注入CDDP或NLDDP,在用药后不同时间点上处死小鼠。取肿瘤组织,进行流式细胞仪分析细胞周期分布和细胞凋亡率。4.选用Lewis肺癌荷瘤小鼠,分成单纯照射组、NLDDP联合照射组、CDDP联合照射组,每大组荷瘤小鼠又按照照射剂量不同分为亚组。观察肿瘤生长情况,根据Compertz模型得出剂量效应曲线,求出三组达到相同肿瘤生长延迟时间所需的照射剂量,单照组与药物联合照射组剂量之比即为放射增敏比。同时观察药物联合照射对小肠损伤的生物效应。C57 BL/6N小鼠按给与药物和照射剂量不同分组,进行全腹照射。照射结束后3.5天处死小鼠,取小肠进行切片,计数再生隐窝数。采用线性二次(LQ)数学模型进行细胞存活曲线拟合。放射增敏比为药物联合照射组和单纯照射组生存曲线LQ方程的β值之比。药物对肿瘤组织和对正常组织的放射增敏比之比为治疗增益因子。结果1.深部X射线对NLDDP体外药物释放没有明显影响。血浆药物动力学实验发现,CDDP组小鼠在注射后游离铂立即达到最高血药浓度3.24μg/ml,并迅速降低,2 h后在血液中已经无法检测出游离铂。NLDDP组小鼠注射后1 h,血浆游离铂达峰浓度13.79μg/ml,是CDDP组峰浓度的4倍多。72 h后血药浓度为1.04μg/ml。肿瘤和正常组织中总铂含量检测发现,NLDDP组荷瘤小鼠肿瘤组织中总铂含量峰浓度达8.96±1.01 mg/kg,明显高于CDDP组的1.99±0.77mg/kg;在用药后72小时内,NLDDP组中肿瘤组织中总铂曲线下面积(AUC)显著高于CDDP组,是它的7.48倍。在肝脏、肺及肾脏组织中,LDDP组AUC也高于CDDP组,分别是它的3.17倍、3.30倍和2.40倍。2.单纯脂质体外无细胞毒性;NLDDP对A549细胞的IC50为0.95μg/ml,毒性为CDDP(2.13μg/ml)的2.24倍;药物联合照射对肿瘤细胞增殖毒性大于单纯用药组和单纯照射组,其中NLDDP联合照射组肿瘤细胞的集落形成率低于CDDP联合照射组。3.在Lewis肺癌和黑色素瘤荷瘤小鼠中,NLDDP与CDDP比较均表现了更好的抗肿瘤作用。NLDDP与照射联合,最长可以使Lewis肺癌荷瘤鼠的TGD时间达15.29天,明显长于CDDP联合照射组的6.65(P=0.003)。用药后不同时间照射,小鼠的肿瘤生长差异显著,尤以用药后72小时照射肿瘤生长缓慢。NLDDP与CDDP联合照射可延长荷瘤小鼠的生存期,差异有统计学意义(P=0.0001)。荷瘤小鼠静脉注射NLDDP和CDDP后不同时间肿瘤组织流式细胞分析未发现差异。4.在Lewis肺癌荷瘤小鼠中,NLDDP与CDDP与对照组均表现了更好的抗肿瘤作用,SER分别为4.92和3.22。NLDDP与CDDP联合照射对小肠上皮的损伤增加,SER分别为1.154和1.192。NLDDP与CDDP这两种药物联合照射的的TGF分别为4.263和2.071。结论1.深部X射线对NLDDP体外释放的速度无明显影响;NLDDP静脉注射后在体内的循环时间长于CDDP,在肿瘤组织中的分布也高于CDDP组,说明NLDDP有长循环和被动靶向分布的作用。2.本研究制备NLDDP所采用的脂质成分体外无细胞毒性,NLDDP与CDDP相比,增加了对人肺癌A549细胞的毒性,与照射联合后对肿瘤细胞的体外增殖毒性增加。3.NLDDP可延长荷瘤鼠的局部肿瘤控制时间及生存时间,对细胞周期的影响和CDDP无差别。4.NLDDP和CDDP均有放射增敏作用,NLDDP的增敏作用大于CDDP,且可以获得更好的治疗增益。