植物重金属富集和耐受的分子机制已逐渐明晰，植物体内含有多种重金属诱导相关功能基因，它们在重金属耐性与富集机制中发挥着重要作用。植物络合素合酶能够合成植物体内一种重要的重金属螯合剂植物络合素。重金属超富集植物作为植物重金属富集、耐受机制研究的主要模式植物，在重金属相关功能基因的发现以及植物耐受生理、重金属元素累积等方面研究起到重要的作用。本文以重金属超富集模式植物遏蓝菜(Thlaspi caerulescens)为研究对象，克隆获得其体内的植物络合素合酶基因TcPCS1，并对该基因在原核、真核酵母细胞以及转基因烟草中的重金属耐受以及富集相关功能进行了研究。　　 ⑴植物络合素合酶基因(TcPCS1)克隆及其表达分析。遏蓝菜TcPCS1基因(Thlaspi caerulescen phytochelatin synthase no.1)编码植物络合素合酶蛋白，该基因具有家族蛋白共有的N-端保守区域与C端非保守区域。TcPCS1基因与AtPCS1基因含有相同数目的内含子和外显子。通过转录水平分析表明TcPCS1基因植株各个组织部位的表达较为平均，为组成型表达。然而，在不同浓度的Zn和Cd的处理下，表达却有较大差异。在100、200以及500μMCd处理下，随着处理时间的延长，其表达量增加；在400μM Zn处理下，在短时间内基因表达量则出现降低，但是经过处理时间的延长其表达量有所恢复。说明TcPCSI基因虽然为组成型表达，但是在受到重金属金属诱导下，表达模式会受到诱导调控，因其合成产物PCs在重金属螯合解毒过程中发挥重要作用而受到调节。　　 ⑵植物络合素合酶基因(TcPCS1)的原核表达功能分析。为了研究TcPCS1cDNA在原核细胞中表达对重金属毒害的作用，试验选取AtPCS1基因作为功能对照，与空载体一同转化大肠杆菌BL21菌株。结果发现，TcPCS1与AtPCS1转化子的重金属耐性和累积能力，在含有CdCl2和ZnCl2处理组均好于对照空载体组，Cd累积量高于对照组3.8倍和3.5倍，Zn累积量显著高于对照组。同时TcPCS1与AtPCS1转化子中的PC含量分别是空载体的3.3倍和2.9倍，这说明PCS基因的过量表达使得大量的PC在细菌体内合成，对进入细胞内的重金属进行螯合解毒，降低对细胞的毒性，因而生长状态较好。Zn的累积量与对照也有显著差异，可能是由于Zn元素在细胞生理以及蛋白中的作用原因，这一差异与Cd累积相比则较小。　　 ⑶植物络合素合酶基因(TcPCS1)的酵母表达分析。酵母细胞作为真核功能研究的表达受体，广泛应用于重金属相关基因功能研究。本试验将TcPCS1转化重金属敏感型菌株YK44，进行了酵母重金属耐性以及两种金属离子的协同吸收分析。TcPCS1转化子在100μM，Cd和1 mM Zn处理下，生长状况明显好于对照空载体，同时PC含量检测显示TcPCS1表达后，在20μM Cd和50μMZn处理下，PCs含量分别为空载体转化子的3.15倍和3.24倍。同时发现在Cd含量固定时，逐渐添加外源Zn时，转基因酵母与对照组的Cd含量没有发生明显区别，PC含量检测结果与重金属结果相类似。说明当Zn存在时对转基因酵母的Cd的累积没有明显影响。　　 ⑷植物络合素合酶基因(TcPCS1)的烟草表达分析。构建TcPCS1正、反义基因双子叶表达载体TcPCS1-03、anti-TcPCS1-03转化烟草，经过筛选获得TcPCS1阳性转化株pcs6、pcs47和anti1、anti2。通过萌发实验结果显示：野生型和正义TcPCS1基因转化植株在种子萌发时间比较中无较大差异，而反义基因的转基因株的种子萌发时间滞后；而植株表型分析发现反义基因的转基因植株的胚根和胚轴要小于野生型和正义基因转基因植株。根系生长以及水培条件下的重金属耐性实验结果显示：反义TcPCS1基因转化至烟草中可能抑制了转基因植株体内正常的PC合酶基因的转录而造成PCs的合成被抑制，从而影响到株系的重金属整合解毒作用，造成耐性降低。而过量表达TcPCS1c DNA的株系在Cd耐性方面要好于野生型。pcs6和pcs47植株根部Cd含量分别为野生型植株的1.47倍和1.36倍。而地上部分的Cd含量分别是野生型的1.36倍和1.24倍。所以，TcPCS1基因的过量表达显著增加了pcs转化植株中对Cd的累积。TcPCS1转基因植株的根部与地上部分Cd含量分别是野生型植株的1.42倍和1.3倍。转基因植物在根部和地上部分组织中Cd含量较野生型植株有显著的增加。　　 ⑸通过对抗氧化系统中的各种酶类以及MDA含量的测定，发现野生型植株的MDA在100μM CdCl2处理下的含量要高于转基因株系，这说明重金属对野生型植株的细胞膜的伤害高于转基因植株。过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)在对照条件下，野生型与转基因植株没有明显差别；在100μMCdCl2处理下转基因植株的CAT活性高于野生型植株，而SOD和POD的活性均是随着处理时间的延长而逐渐升高，转基因植株的SOD和POD活性增加较为迅速，相比之下，两种酶的活性在野生型植株中则显得增加较为平缓。这一结果可能说明TcPCS1的过量表达可能增加了转基因植株在遇到重金属毒害时的抗氧化活性，从而降低了氧化损伤。