神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是一种常见于婴幼儿外周神经系统的恶性肿瘤,是常见起源于交感神经系统神经嵴的胚胎实体瘤。神经母细胞瘤在遗传学上表现为各种染色体异常,其典型特征是转移,尤其是多部位、多灶性早期转移,其中早期骨髓转移在临床最为常见,其增殖及转移机制较为复杂,普遍认为酪氨酸激酶受体及其配体在神经母细胞瘤的发生、分化、细胞增殖、血管生成及转移、凋亡等方面发挥调节作用。目前国内的主要对神经母细胞瘤的治疗方法是手术、放化疗、干细胞移植加强化疗及诱导分化维持治疗等综合治疗,较之前极大地提高了晚期NB患儿的五年生存期,目前晚期NB患儿的五年生存率维持在50%左右。但是,晚期NB患儿治疗方法已进入瓶颈期,且NB属于少见癌种,对于NB的认识及治疗水平差异较大,这就加大了NB的复杂性和难治性。相较于国内,免疫靶向治疗和131I-MIBG放疗等特异性治疗手段已在西方发达国家得到应用,对于晚期NB的治疗具有较好的临床疗效。因此,在未来的临床治疗中应更加注重具有更强的特异性和敏感性的靶向治疗的应用,而寻求新而有效的潜在NB分子靶点是非常必要的。核糖体是细胞合成蛋白的主要场所,其主要组成成分是蛋白质和RNA,对细胞的生长和增殖发挥着重要的作用。核糖体最重要的生物学行为是蛋白质的生物合成。核糖体合成调节蛋白1(Regulator of ribosome synthesis 1,RRS1)最早在酵母中被发现,人RRS1基因定位在染色体8q13.1,染色体位置在66429028–66430733bp,人RRS1主要定位于核仁和内质网上。RRS1是一个多功能蛋白,作为一种核糖体合成调节蛋白,它参与pre-rRNA的加工,还参与60S核糖体亚单位从核仁向细胞浆的运输。RRS1可以根据细胞的状态调节核糖体合成的速度,从而保持细胞内的稳态,是蛋白质分泌与核糖体合成信号转导途径中的一个重要蛋白质。近年来,关于RRS1基因与疾病的相关性研究也日益增多,早在2009年Carnemolla等人报道,RRS1基因与人类亨廷顿病(Huntington disease,HD)的发生发展相关,研究结果显示RRS1基因在HD中的表达量显著升高。最近的研究发现,RRS1基因的异常表达与宫颈癌、肝癌、结直肠癌等癌症密切相关,且本课题组前期研究表明RRS1基因与乳腺癌的增殖相关。但是目前对RRS1基因在神经母细胞瘤中的功能尚未见报道,在本研究中我们将探索RRS1基因在神经母细胞瘤中的功能及其与神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的调节机制。目的:(1)检测RRS1基因在神经母细胞瘤组织中的表达水平,并探讨其与神经母细胞瘤临床病理特征及生存率之间的关系。(2)研究RRS1基因对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡能力的影响。(3)探讨RRS1基因与神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的调节机制。方法:(1)采用免疫组织化学方法(Immunohistochemistry,IHC)检测神经母细胞瘤组织中RRS1蛋白表达水平,统计其与患者临床病理特征及生存预后的相关性。(2)体外培养神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y、乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、BT549及正常乳腺细胞HMEC,并采用qPCR检测各细胞系中RRS1基因的mRNA表达水平。(3)采用CRISPRCas9和RNA干扰技术构建慢病毒载体,感染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,分别在DNA水平敲除和转录后水平敲减RRS1基因的表达量。(4)采用Cruise酶切检测Cas9的敲除效率,通过qPCR和Western Blot方法检测RRS1基因在mRNA水平和蛋白水平的敲减效率。通过MTT实验及克隆形成实验检测细胞的增殖活力;采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡水平;通过划痕实验及Transwell实验检测细胞的迁移能力;通过侵袭实验检测细胞的侵袭能力。(5)通过Western blot法检测RRS1基因敲减后,神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中凋亡相关蛋白P53、P21、Bcl-2及Bax的表达情况,探讨RRS1调节细胞凋亡的分子机制。结果:(1)免疫组化结果显示,45例神经母细胞瘤组织中RRS1蛋白阳性表达16例,阳性率为35.6%。(2)生存预后分析显示,神经母细胞瘤患者年龄大部分是在10岁以下,RRS1蛋白表达阳性在转移人群和未转移人群之间的分布存在差异(p<0.05),RRS1阳性表达与死亡存在明显的相关性(p<0.01)。提示RRS1阳性为神经母细胞瘤转移的独立危险因素(p<0.05),也是死亡的关键因素(p<0.01)。(3)神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞、正常乳腺HMEC细胞及乳腺癌MDA-MB-231、BT-549、MDA-MB-453、MCF-7细胞中RRS1基因mRNA的ΔCt值分别为3.46±0.30、13.18±0.24、12.44±0.08、9.95±0.48、11.11±0.60、7.42±0.22,RRS1基因在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的表达量明显高于正常乳腺细胞及乳腺癌细胞。(4)CRISPRCas9慢病毒感染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后,敲除SH-SY5Y细胞中RRS1基因的表达,通过WB实验检测细胞蛋白表达水平,Control组RRS1蛋白表达量为1.428±0.350,而KnockOut组RRS1蛋白表达量为0.198±0.128,结果显示Control组RRS1蛋白表达量明显高于KnockOut组(p<0.01)。(5)RRS1-shRNA慢病毒感染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后,敲减SH-SY5Y细胞中RRS1基因的表达,通过WB实验检测细胞蛋白表达水平,NC组mRNA表达量为1.002±0.084,RRS1-shRNA组表达量为0.536±0.016(p<0.01),且RRS1-shRNA组蛋白表达量也明显降低。(6)CRISPRCas9慢病毒感染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,敲除细胞中RRS1基因后:MTT实验显示细胞增殖能力明显下降(p<0.01);克隆形成实验结果显示NC组单细胞克隆数为102±10,而Knockout组克隆数为8±3,克隆形成能力明显降低(p<0.01);细胞周期实验显示NC组细胞,处于G1期的细胞数是43.75%±0.743而Knockout组的细胞处于G1期细胞数目是57.53%±0.580,细胞周期调控紊乱(p<0.01);划痕实验结果显示NC组细胞24h后的迁移率是80.93%±0.0775,Knockout组细胞24h后的迁移率是63.00%±0.0505,细胞迁移能力明显下降(p<0.01);Transwell结果显示NC组迁移到下室的细胞个数是180±3.85,Knockout组迁移到下室的细胞个数是24±4.46,细胞的迁移能力明显降低(p<0.01);侵袭实验结果显示NC组侵袭穿过基质胶膜的细胞个数是157±3.36,Knockout组侵袭穿过基质胶膜的细胞个数是7±0.36,表明细胞的侵袭转移能力明显降低(p<0.01)。(7)shRNA慢病毒感染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,敲减细胞中RRS1基因后:MTT实验显示细胞增殖能力明显下降(p<0.05);克隆形成实验结果显示NC组单细胞克隆数为75±3,而RRS1-shRNA组克隆数为10±2,克隆形成能力明显降低(p<0.01);细胞周期实验显示NC组细胞,处于G1期的细胞数是32.15%±0.7199而RRS1-shRNA组的细胞处于G1期细胞数目是69.36%±0.3879,细胞周期被明显阻滞在G1期(p<0.01);细胞凋亡实验结果显示NC组早凋细胞比例是2.21%±0.1234,RRS1-shRNA组早凋细胞比例是7.24%±0.3465,细胞早期凋亡率明显增多(p<0.01);划痕实验结果显示NC组细胞24h后的迁移率是16.31%±0.0181,RRS1-shRNA组细胞24h后的迁移率是9.79%±0.0346,细胞迁移能力明显下降(p<0.01);Transwell结果显示NC组迁移到下室的细胞个数是219±4.72,RRS1-shRNA组迁移到下室的细胞个数是11±1.10,细胞的迁移能力明显降低(p<0.01);侵袭实验结果显示NC组侵袭穿过基质胶膜的细胞个数是191±2.17,RRS1-shRNA组侵袭穿过基质胶膜的细胞个数是60±2.81,细胞的侵袭转移能力明显降低(p<0.01)。(8)敲减神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞RRS1基因后,凋亡相关蛋白p53、p21、Bax表达量明显提高,癌基因Bcl-2蛋白表达量明显降低,p53蛋白与MDM2的相互作用降低。结论:(1)RRS1基因在神经母细胞瘤组织中有阳性表达,主要定位于细胞核中,呈淡黄色至棕黄色颗粒,部分在胞浆弱阳性表达。(2)RRS1基因阳性表达与神经母细胞瘤患者的转移及死亡密切相关。(3)RRS1基因在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中高度表达,敲除及敲减RRS1基因的表达后,SY5Y细胞的增殖、迁移、侵袭能力明显下降,凋亡水平明显升高。(4)敲减神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞RRS1基因能诱导p53、p21蛋白的激活,从而导致细胞周期的阻滞及细胞凋亡的增多。RRS1基因可能是通过p53-MDM2信号通路调控细胞的凋亡及周期。