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海参具有极强的自溶能力,当受到外界刺激时即发生降解。研究发现存在于海参体壁和肠道中的一系列内源性组织蛋白酶是海参自溶的主导因素。因此,对海参组织蛋白酶B的研究将为调控海参自溶提供理论依据。本文首先研究了海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化及部分酶学性质,然后对组织蛋白酶B进行抗体制备,并用紫外照射诱导海参自溶,对海参自溶前后体壁和肠道中组织蛋白酶B的分布进行了初步研究。新鲜海参肠经含 5 mmol/L L-Cys、1 mmol/L EDTA、0.2％Triton X-100 的 50 mmol/L pH 5.0的NaAc-HAc缓冲液匀浆破碎,浸提7 h后,80%硫酸铵饱和度盐析,再经DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换层析、Sephadex G-75和TSK-GEL 3000 SWxl凝胶层析获得纯化的组织蛋白酶B。组织蛋白酶B经一系列柱层析纯化81.26倍。纯化后的酶经Native-PAGE测定得到一条带,经SDS-PAGE测定得到两条带,分子量约为23 kDa和26 kDa。以Z-Arg-Arg-MCA为组织蛋白酶B的特异性底物,经测定纯化酶的最适pH和温度分别为5.5和45℃,偏酸性范围酶的稳定性好,不高于55℃的温度下酶活力稳定。Ca2+、Mg2+对该酶抑制微弱,Mn2+、Fe2+和Fe3+对该酶有一定的抑制作用,Ni2+、Cu2+、Zn2+则能完全抑制该酶的活性。巯基抑制剂E-64和碘乙酸对酶完全抑制,而巯基激活剂DTT、L-Cys和EDTA对酶则具有一定激活作用,说明纯化得到的酶分子含巯基基团;丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF、TI)和金属蛋白酶抑制剂(1,10-菲啰啉)对酶抑制明显;作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂的抗痛素和亮肽酶素均强烈抑制酶活,其中抗痛素可完全抑制酶活,说明纯化出的酶属于半胱氨酸蛋白酶。纯化后的酶作为抗原免疫大鼠制备抗体,抗体经Protein G 2mL亲和层析得到纯化,由SDS-PAGE电泳检测,纯化出的抗体IgG纯度达90%以上。由免疫组化技术对海参自溶前后体壁和肠道中组织蛋白酶B的分布进行了初步研究,结果表明紫外诱导自溶的海参体壁及肠道组织蛋白酶B均广泛存在。