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黄花苜蓿（Medicago falcata L.）是一种非常抗寒、抗旱及耐贫瘠的豆科牧草，可作为牧草抗逆育种的基因库。本实验室前期做了黄花苜蓿冷响应基因的表达谱，本文选择两个与低温驯化相关的基因（MfAIR12和MfWAK）进行研究，并初步揭示其耐寒机理，主要结果如下：
MfAIR12基因研究结果
1. MfAIR12（Auxin induced in root cultures）是从黄花苜蓿低温响应表达谱中筛选出的，该基因受生长素诱导，影响根的生长。该基因ORF是693bp，编码231个氨基酸，含有较多的亲水性氨基酸，是一个靠近质膜外侧的跨膜蛋白。序列同源性分析，MfAIR12与其他模式植物的同源性不高，并不是一个进化上保守的蛋白。
2.获得了表达 MfWAK基因的转基因烟草。荧光定量 PCR分析表明转基因烟草中MfAIR12有表达，而野生型（WT）中不能检测到。与野生型相比，低温处理后，过表达MfAIR12提高转基因烟草存活率，半致死温度（LT50）降低。转基因烟草积累更多的H2O2，低温处理后，抗氧化酶活性及其基因表达显著提高。
3.采用荧光定量PCR检测了转基因烟草及WT中NtDREB1、NtDREB2、NtDREB3、NtDREB4和Cor15a的表达量，结果显示，低温条件下这些基因的表达存在显著差异，转基因烟草中的表达量高于WT，表明MfAIR12参与转基因烟草中系列低温响应基因的表达调控。
5.我们还对拟南芥air12突变体及其WT抗冻性进行了比较，在不进行低温驯化或进行驯化处理条件下，air12突变体的LT50均高于野生型，存活率低于野生型。低温处理后，与野生型相比，air12突变体存活率降低，LT50升高，CBF1-3及冷响应基因RD29A、RD29B、Cor15a、KIN1和COR47的表达量显著降低，表明MfAIR12通过提高抗氧化酶活性和上调多个冷响应基因的表达，正调控植物耐寒性。
MfWAK基因研究结果
1. WAK（wall associated kinase）是细胞壁相关激酶。MfWAK基因是从黄花苜蓿低温响应表达谱里筛选出来的，根据截形苜蓿的同源序列设计引物，从黄花苜蓿中克隆得到一条长2353bp的序列，测序结果表明，该基因是细胞壁相关类受体蛋白激酶（wall-associated receptor protein kinase，WAK）类基因，我们把它命名为MfWAK。MfWAK含有2100bp的开放阅读框，编码699个氨基酸。预测该蛋白的分子量为77.17kDa，等电点为7.1。MfWAK具有EGF结构域，跨膜结构域和保守的胞内激酶结构域，在 N末端含有信号肽序列。系统进化树分析表明 MfWAK与拟南芥AtWAKL14亲缘关系最近，属于第四类WAK/WAKL蛋白家族。
2.荧光定量PCR结果显示，正常情况下，MfWAK主要在黄花苜蓿叶柄和根中表达，而在叶、花中未检测到。MfWAK受低温诱导表达，随低温处理时间，表达量呈上升趋势；该基因也受 H2O2，盐和脱水处理诱导表达。MfWAK::GFP融合蛋白定位到细胞膜上。
3.构建MfWAK基因过表达载体，获得截形苜蓿的转基因植株。在冷驯化和非冷驯化条件下，过表达MfWAK截形苜蓿半致死温度低于野生型。当低温处理2 h后，过表达植株中CBF1、2、3的表达量显著高于野生型，而CBF4的表达在过表达植株与野生型之间没有差异。低温处理2 h后，转基因植株中CAS15和COR413的表达量显著高于野生型；处理2 h后，转基因植株中LTI65和LTI6A的表达量与野生型差异不显著，处理24 h后，转基因植株中两个基因的表达量显著高于野生型。wak基因缺失突变体存活率降低，LT50升高，植物抗冻性降低。
4.转基因拟南芥与野生型相比，存活率高于野生型，而半致死温度低于野生型。转基因拟南芥中CBF基因及其下游COR基因的表达高于野生型。
5.过表达 MfWAK提高柱花草最大光化学效率（Fv/Fm），降低其相对电导率，提高转基因柱花草抗冷性。
MfAIR12基因研究结果
1. MfAIR12（Auxin induced in root cultures）是从黄花苜蓿低温响应表达谱中筛选出的，该基因受生长素诱导，影响根的生长。该基因ORF是693bp，编码231个氨基酸，含有较多的亲水性氨基酸，是一个靠近质膜外侧的跨膜蛋白。序列同源性分析，MfAIR12与其他模式植物的同源性不高，并不是一个进化上保守的蛋白。
2.获得了表达 MfWAK基因的转基因烟草。荧光定量 PCR分析表明转基因烟草中MfAIR12有表达，而野生型（WT）中不能检测到。与野生型相比，低温处理后，过表达MfAIR12提高转基因烟草存活率，半致死温度（LT50）降低。转基因烟草积累更多的H2O2，低温处理后，抗氧化酶活性及其基因表达显著提高。
3.采用荧光定量PCR检测了转基因烟草及WT中NtDREB1、NtDREB2、NtDREB3、NtDREB4和Cor15a的表达量，结果显示，低温条件下这些基因的表达存在显著差异，转基因烟草中的表达量高于WT，表明MfAIR12参与转基因烟草中系列低温响应基因的表达调控。
5.我们还对拟南芥air12突变体及其WT抗冻性进行了比较，在不进行低温驯化或进行驯化处理条件下，air12突变体的LT50均高于野生型，存活率低于野生型。低温处理后，与野生型相比，air12突变体存活率降低，LT50升高，CBF1-3及冷响应基因RD29A、RD29B、Cor15a、KIN1和COR47的表达量显著降低，表明MfAIR12通过提高抗氧化酶活性和上调多个冷响应基因的表达，正调控植物耐寒性。
MfWAK基因研究结果
1. WAK（wall associated kinase）是细胞壁相关激酶。MfWAK基因是从黄花苜蓿低温响应表达谱里筛选出来的，根据截形苜蓿的同源序列设计引物，从黄花苜蓿中克隆得到一条长2353bp的序列，测序结果表明，该基因是细胞壁相关类受体蛋白激酶（wall-associated receptor protein kinase，WAK）类基因，我们把它命名为MfWAK。MfWAK含有2100bp的开放阅读框，编码699个氨基酸。预测该蛋白的分子量为77.17kDa，等电点为7.1。MfWAK具有EGF结构域，跨膜结构域和保守的胞内激酶结构域，在 N末端含有信号肽序列。系统进化树分析表明 MfWAK与拟南芥AtWAKL14亲缘关系最近，属于第四类WAK/WAKL蛋白家族。
2.荧光定量PCR结果显示，正常情况下，MfWAK主要在黄花苜蓿叶柄和根中表达，而在叶、花中未检测到。MfWAK受低温诱导表达，随低温处理时间，表达量呈上升趋势；该基因也受 H2O2，盐和脱水处理诱导表达。MfWAK::GFP融合蛋白定位到细胞膜上。
3.构建MfWAK基因过表达载体，获得截形苜蓿的转基因植株。在冷驯化和非冷驯化条件下，过表达MfWAK截形苜蓿半致死温度低于野生型。当低温处理2 h后，过表达植株中CBF1、2、3的表达量显著高于野生型，而CBF4的表达在过表达植株与野生型之间没有差异。低温处理2 h后，转基因植株中CAS15和COR413的表达量显著高于野生型；处理2 h后，转基因植株中LTI65和LTI6A的表达量与野生型差异不显著，处理24 h后，转基因植株中两个基因的表达量显著高于野生型。wak基因缺失突变体存活率降低，LT50升高，植物抗冻性降低。
4.转基因拟南芥与野生型相比，存活率高于野生型，而半致死温度低于野生型。转基因拟南芥中CBF基因及其下游COR基因的表达高于野生型。
5.过表达 MfWAK提高柱花草最大光化学效率（Fv/Fm），降低其相对电导率，提高转基因柱花草抗冷性。