论文部分内容阅读
中国是一个盛产水稻和小麦的农业大国,每年加工稻米和小麦面粉副产米糠超过1000万吨、麸皮超过3000万吨。寻求新的高效高值化深加工米糠和麸皮的新技术,对提升中国农业及相关企业的竞争力具有重要意义。灰树花是一种药食两用真菌,富含多种营养物质,具有多种生理活性功能,如增强免疫力、辅助抗肿瘤治疗、护肝等。灰树花的各种酶可降解米糠和麸皮。液态发酵是一种快速、可工业化大规模生产技术。为高效高值化转化利用米糠和麸皮,本文的研究主题是利用灰树花诱变新菌株液态发酵不加或加硒米糠和麸皮全料获得所需产物,如灰树花菌丝体、菌丝多糖、富硒菌丝和富硒多糖等产物,涉及菌株诱变、发酵工艺、发酵动力学、富硒发酵工艺、富硒发酵动力学等新问题,具体研究内容和结果如下所述。(1)针对已有灰树花菌株Grifola frondosa CCTCC M2011113,进行紫外或微波诱变改良,以求获得能更好降解米糠和麸皮的灰树花新菌株。分别经过连续10批诱变处理和培养皿培养初筛、复筛及摇瓶发酵筛选,得到紫外诱变新菌株Grifola frondosa JSULIU-D1和微波诱变新菌株Grifola frondosa JSULIU-D2各一株。在100mL米糠和麸皮培养基中液体发酵,Grifola frondosa JSULIU-D1和Grifola frondosa JSULIU-D2的菌丝原料混合物干重分别为1.7g和1.6g,菌丝混合物多糖分别为110mg和135mg,两新菌株生长速度快,达到102mm/h,菌丝混合多糖较Grifola frondosa CCTCC M2011113分别提高20%和50%,但紫外诱变新菌株发酵原料较彻底,相对较优。(2)对Grifola frondosa JSULIU-D1的发酵工艺进行了研究,包括10个单因素影响试验,培养基均匀设计试验,10L、50L和500L罐放大试验。单因素及水平范围为转速60-210r/min、温度16～36℃、米糠浓度20～100g/L、麸皮浓度20～100g/L、磷酸二氢钾浓度0～3.6g/L、七水硫酸镁浓度0～3.6 g/L、接种量4～20%、发酵醪pH3～11、250 mL锥形瓶装50～200 mL、发酵时间2-12 d。6个研究指标为分离出的菌丝干重、残渣干重、干物质失重、菌丝多糖重量、胞外糖重量和酵后总糖重量。测出了60条指标变化曲线,并对各因素对发酵的影响规律进行了分析,为发酵工艺的选择提供了试验和理论依据。采用U15(54)设计表,对培养基进行初步的均匀设计U15(54)试验研究,米糠浓度10-50g/L、麸皮浓度10～30g/L、磷酸二氢钾浓度0-3.6g/L、七水硫酸镁浓度0-1.6g/L,试验指标为残留原料的菌丝原料混合物干重、干物质失重、菌丝原料混合多糖重量、胞外糖量重、总糖重量,得到5个指标的模型方程,并由此分析出本研究阶段所得的优化培养基组成为：米糠50g/L、麸皮30g/L、七水硫酸镁0.8g/L。其它较为合理的工艺条件为：装样体积分率40%,pH自然,接种量10%,转速150r/min,温度28℃,发酵时间9d。发酵结果为：菌丝原料混合干重浓度30.9g/L,干物质失重浓度25.5g/L,菌丝原料混合多糖浓度0.9g/L,胞外多糖浓度2.91g/L,总多糖浓度3.81g/L。实现10L、50L和500L发酵罐的放大试验,得到各次试验的投料和产物的概要表。500L罐的放大试验采用的培养基组成为米糠74.34g/L、麸皮9.66g/L、磷酸二氢钾3.6g/L、七水硫酸镁浓度3.6g/L,以1m3原始发酵醪为基准,获得17.0kg绝干菌丝混合物,11.0kg外物质。(3)采用U24(245)设计表,对100mL初始培养基中的米糠重量、麸皮重量、磷酸二氢钾重量、七水硫酸镁重量及时间5个因素和对应的水平进行均匀设计试验,以纯菌丝干重为指标,求得Grifola frondosa JSULIU-D1液态发酵米糠和麸皮全料经验动力学模型方程。根据经验模型方程求得本研究阶段的菌丝干重浓度为指标的最优发酵工艺为：培养基组成为米糠48.0g/L、麸皮34.4g/L、磷酸二氢钾3.6g/L、七水硫酸镁1.8g/L,接种量10mL,100mL发酵醪装样于250mL锥形瓶,发酵温度28℃,摇床转速150r/min,发酵时间为5.44d,菌丝干重浓度为23.47±1.32g/L。(4)采用Uzo(204)设计表,根据(3)的菌丝生长经验动力学模型方程,预测了100mL初始培养基组成的均匀设计20组试验的不同时间的菌丝生长重量,并据此求出了理论动力学Logistic型模型方程及模型参数μm和Cmax与米糠重量、麸皮重量、磷酸二氢钾重量、七水硫酸镁重量的回归关系式。(5)采用U24(245)设计表,对100mL初始培养基的米糠重量(1L醪的麸皮浓度对应为86.25-米糠浓度)、加硒重量、磷酸二氢钾重量、七水硫酸镁重量及时间5个因素和对应的水平进行了均匀设计试验,分别测出了分离出的菌丝干重、残渣干重、干物质失重、菌丝多糖重量、胞外多糖重量、总多糖重量、菌丝硒重、单位菌丝重的硒重及硒的转化率等9个指标对应的数值,并分别以菌丝干重、菌丝多糖重量、胞外多糖重量、菌丝硒重为指标,求取得到Grifola frondosa JSULIU-D1液态发酵加硒米糠和麸皮全料的相应的经验动力学模型方程,根据以上方程求解的结果,推荐的较优工艺是：米糠86.25g/L(可用低于25%的麸皮替代部分米糠)、麸皮0g/L、硒0.319mg/L、钾盐0.15g/L、镁盐0.15g/L,时间9d,所得菌丝干重浓度为35.44g/L,菌丝多糖可达1.931g/L,菌丝硒浓度为1.546mg/L,胞外多糖为2.43g/L。其它工艺条件为250 mL锥形烧瓶装样100mL,接种量为10mL,发酵温度28℃,摇床转速150r/min。(6)Grifola frondosa JSULIU-D1液态发酵加硒米糠和麸皮全料时,并且在250 mL锥形烧瓶中接种10mL,装样100 mL,发酵温度28℃,摇床转速150r/min不变,四个主要指标的最高浓度和条件分别为：菌丝干重浓度最高可达42.48g/L,其中菌丝硒为154mg/L,对应于米糠86.25 g/L、麸皮0 g/L、硒0.319mg/L、磷酸二氢钾3.6g/L、七水硫酸镁3.6g/L,时间为8.93d；菌丝多糖浓度最高可达2.655g/L,对应于米糠86.25 g/L、麸皮0g/L、硒5.182mg/L、磷酸二氢钾0.15g/L、七水硫酸镁0.15g/L,时间为6.11d；胞外多糖最高可达9.231g/L,对应于米糠0g/L、麸皮86.25g/L、硒7.65mg/L、磷酸二氢钾0.15g/L、七水硫酸镁3.6g/L,时间为12d;菌丝硒浓度最高可达3.995mg/L,对应于米糠86.25g/L、麸皮0g/L、硒765mg/L、磷酸二氢钾0.15g/L、七水硫酸镁0.15g/L,时间为12d。(7)采用U20(204)设计表,根据(5)的富硒时的菌丝生长经验动力学模型方程,预测了100mL初始培养基的成分均匀设计20组试验不同时间的菌丝生长重量,并据此求出富硒时的菌丝干重的理论动力学L ogistic型模型方程及其模型参数μm和Cmax与米糠重量(包括麸皮重量)、加硒重量、磷酸二氢钾重量、七水硫酸镁重量的回归关系式。(8)采用纳米粉碎技术对冻干菌丝进行粉碎,用扫描电子显微镜(SEM)分析表征证明可以达到100%的破壁效果,为直接使用菌粉提供了依据；对菌丝中的硒及重金属Pb、Hg、Cd采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)进行了分析,所测重金属残留基本合格,开发产品应注意控制原料；对产物的游离氨基酸采用氨基酸分析仪进行分析表征,游离氨基酸含量为80-100g/kg干菌丝,且8种必需氨基酸占50%左右。