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目的:多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)属中枢神经系统(Central nervous system,CNS)自身免疫性疾病,在世界范围内的发病率呈逐年上升趋势,为青壮年致残的主要神经系统疾患之一,已对人类的健康和劳动力资源构成了严重的威胁。目前临床上尚无针对本病的理想疗法。实验性变态反应性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是T细胞介导的CNS脱髓鞘疾病,是研究人类脱髓鞘疾病MS的理想动物模型,二者在致敏抗原、临床表现、组织病理改变和发病机理等方面均类似。通过动物模型口服抗原诱导免疫耐受是目前治疗EAE乃至MS的研究热点,尽管其机制尚不十分明确,但已受到国内外学者越来越多的关注。本研究在建立大鼠EAE模型基础上,以所提取的髓鞘素做为自身口服抗原,用于诱导免疫耐受。并从分子水平上分析口服组和EAE对照组在病程不同阶段(发病早期、高峰期及恢复期)对外周免疫器官中细胞因子mRNA的表达特征,研究细胞因子与EAE发病及口服耐受的关系;同时在EAE病程不同阶段检测外周免疫器官及CNS内细胞凋亡的变化情况,进而探讨免疫耐受的机制,为EAE、MS的防治提供依据。 方法:本研究共分三部分。第一部分为髓鞘素的提取与鉴定,采用不连续梯度离心的方法从牛脊髓白质中提取 中文摘要髓鞘素,通过SDSPAGE分子量蛋白电泳检测其主要成分,并通过致敏豚鼠的方法检测其抗原活性,结果显示,髓鞘素的主要成分为大分子量髓鞘碱性蛋白(Myelin basicProtein,MBP人 并具有较强的致 EAE生物学活性;第二部分为EAE动物模型的建立及评价,通过四足垫皮下注射豚鼠脊髓匀浆/完全福氏佐剂(GPSCHCFA人后足路背面真皮内注时百日咳疫苗的方式免疫大鼠,成功地诱导出EAE模型;第三部分为口服髓鞘素对EAE的防治作用及口服耐受扒理研究,以所提取的髓鞘素做为自身抗原,于免疫前7、5、2大、免疫日及免疫后2、5、7大给大鼠口服,剂量为 5 mg/只·次,总量为 3 5 mg/只。免疫日定为第 0大。观察动物发病情况并分别于免疫后第 9、13、23天取材。取动物外周淋巳结及脾,用反转录-聚合酶链反应(RTPCR)半定量法检测外周淋巴结中细胞因子 mRNA的表达情况,同时应用流式细胞仪吓CM)分析 DNA倍体、进行常规HE染色及原位细胞凋亡检测等方法观察外周免疫器官中细胞凋亡情况:并对**S进厅常规*E染色、原位细胞凋亡检测,研究CNS中细胞凋亡情况。所得各项结果分别同对照组比较,并进行统计学处理。 结果:1.动物发病情况 对照组大鼠最早于免疫后第 9天开始发病,平均发病时间为免疫后第 10刁士 1石天,口服组发病时间较对照组推迟,平均发病时间为兔疫后第11.8士2.4天。口服组症状级别为 2.0士 l.76级,对照组 3.4土1.引级,k0刀5:口服组发病率为刀%,对照组90%,P>0刀5;病理学检查,口服组**S中单个核细胞浸润的数目和范围较对照组明显减少。 中文摘要 2.RTPCR半定量分析 口服组与对照组均表达炎性 细胞因子肿瘤坏死因子-a(Tmow necrosls factor-a, TNF-a)TnRNA;同对照组相 *,口服组 TNFa TnxvA 的表达明显减少;两组均表达抗炎性细胞因子转化生长因 子-p(Transforming gTowth factor-D,TGF-p)mRNA, 同对照组相比,口服组TGF-p nutvA的表达增加。各组 内部,TNFQ TmtNA的表达随症状的加重而增加,TGF pmRNA的表达随症状的加重而下降。 3.流式细胞仪检测结果 口服组与对照组脾和淋巴 结中细胞凋亡率均较低,各组之间及组内无显著性差异。 4.原位细胞凋亡检测结果 门)脾和淋巴结中细胞 凋亡情况:口服组与对照组脾和淋巴结中TUNEL阳性细 胞数量均较少,偶可见阳性细胞。各组之间及组内无显著 性差异。u)脊髓中细胞凋亡情况:正常脊髓中无TUNEL 阳性细胞。EAE对照组动物脊髓中的凋亡现象具有明显 的时程特异性。在EAE早期阶段(免疫后第9大)脊髓 实质内出现大量的TUNEL阳性细胞,并随着病情的进展 而逐渐增多,至疾病高峰期(免疫后第13天)时达到最 高水平,在恢复期(免疫后第23天)数量逐渐减少。日 服组动物的凋亡现象亦具有同样的时程特异性,但各期 TUNEL阳性细胞较EAE对照组减少。各组TmEL阳性 细胞均主要分布于脊髓实质,而血管周围区较少。对同一 蜡块相邻的切片分别行TUNEL染色与HE染色,并进行 对照,从形态学上推断,TUNEL阳性细胞主要为淋巴细 胞、小胶质和巨噬细胞,而星形细胞和神经元则无凋亡现 象。 3 中文摘要