乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着女性的生命健康。全球每年有近130万女性患上乳腺癌,并有超过50万的女性因此而死亡。在我国,女性乳腺癌的发病率和死亡率也呈逐年递增的趋势。根据卫生部2011年的最新统计数据,中国大陆地区每年有超过12.6万女性患上乳腺癌,其中因复发转移而死亡的高达3.7万人。目前以手术为主的综合治疗虽然取得了很好的疗效,但术后复发转移仍是影响生存率和死亡率的主要因素。探讨乳腺癌发生发展的分子生物学机制是近年来转化医学研究的热点之一。目前认为乳腺癌是一种全身性疾病,其发生、进展及转移是一个多基因、多因素共同作用的结果。在过去的几十年里,科学家在肿瘤研究中做出的巨大努力使得我们成功发现了一系列可以作为潜在抗癌靶点的原癌基因和抑癌基因。我们课题组曾经与普林斯顿大学合作,利用信息生物学算法推算出人染色体异常扩增区域8q22在恶性肿瘤中存在明显扩增,而异粘蛋白(Metadherin,MTDH)基因即定位于这一区域的中心位置。MTDH,也被称为AEG-1或Lyric,在2002年作为HIV-1感染后或重组HIV-1衣壳蛋白(gp120)治疗后的一个新的迟发反应基因首先被报道。随后,其全长cDNA序列被四个独立的研究组成功克隆。2004年科学家通过噬菌体展示筛选(phage display screening)技术在MTDH基因中发现了可以调控鼠乳腺癌细胞4T1肺转移的“肺归巢域”,并随后将此基因命名为Metadherin。Kang及其同事首先克隆了人的MTDH全长序列并分析了其结构,发现MTDH基因全长86,082个碱基,包含12个外显子和11个内含子,cDNA序列长3,611个碱基(不包括poly-A尾巴),编码一个分子量约64KD的单次跨膜蛋白。尽管MTDH基因的功能仅被研究了数年,这一新型基因目前已经是调控肿瘤发生进展的重要因子,其在包括癌化、凋亡、侵袭转移、耐药和血管新生等多个肿瘤进展的关键环节均起着重要作用,被认为是一个潜在的肿瘤治疗靶点。MTDH是一个新型的原癌基因,其在乳腺癌中的功能有待进一步研究。本课题拟进一步深入研究MTDH基因在乳腺癌发生发展中的作用,具体内容包括以下三个部分：第一部分乳腺癌中Metadherin基因突变的筛选及其临床意义分析摘要：原癌基因是维持机体正常生命活动所必须的,在进化上高度保守。当原癌基因的结构或调控区发生变异,基因产物增多或活性增强时,细胞便会过度增殖,从而形成肿瘤。原癌基因在各种遗传或环境因素的作用下,可发生结构改变,继而导致细胞生长刺激信号的过度或持续出现,引发细胞转化。引起原癌基因突变的DNA结构改变包括点突变、染色体易位、插入突变、基因扩增等。发现基因中的突变位点可以有助于评价肿瘤的易感性、预测预后及对治疗的反应。MTDH是一个新型的原癌基因,目前为止尚无研究对MTDH基因的突变位点进行检测并评估其与乳腺癌易感性的关系。在本研究中,我们利用基因测序的方法在108例乳腺癌和100例健康对照中对MTDH基因进行全序列分析,以期发现MTDH基因中新的突变位点,并分析这些突变位点在乳腺癌及健康对照中的发生频率以探究其能否作为乳腺癌易感性的重要指标。我们在健康对照组中检测到13个突变位点,而在乳腺癌组中检测到11个突变位点；这其中,共计检测到有9个未命名的新的突变位点。此外,我们还发现无论已知的突变位点还是新的突变位点均倾向分布在MTDH基因的侧翼序列,但是在乳腺癌组中检测到有3个新的突变位点分布在MTDH基因的中央区域,而在健康对照组中未检测到这些突变位点的存在,提示MTDH基因中存在的突变位点可能与乳腺癌的易感性相关。综上,本研究除了检测到MTDH基因已知的突变位点外,发现了数个新的与乳腺癌易感性相关的新的突变位点,可以作为乳腺癌易感性的潜在分子标记物。但是,这些结果需要更大样本量的实验进行验证,这些突变位点跟乳腺癌的预后是否相关也需要进一步的探究。第二部分IniR-30a靶向Metadherin抑制乳11癌的生长与转移摘要：与原发乳腺癌相比,转移性乳腺癌因其不可手术及对化疗耐受的特点常常认为是不可治愈的。尽管目前为止人们已经在肿瘤领域进行了一个多世纪的研究,转移仍然是肿瘤最为神秘的一个生物学特征,对其发生过程的分子机制仍旧知之甚少。探明肿瘤转移过程的确切分子机制对于降低乳腺癌的发生率至关重要。目前研究发现MTDH在乳腺癌转移进展中发挥重要作用,但对于其调控转移的具体分子生物学机制的认识却远远不足。最近,随着人们逐渐破译微小RNA(miRNAs)在众多生物学过程中所起的重要作用,这种情况有望得到改观。这种微小、非编码RNA可以通过结合其靶基因的3’非翻译区实现对其靶基因在转录或翻译水平的调控。越来越多的实验数据表明IniRNAs在乳腺癌发生发展过程中发挥着重要的调节功能。其异常调节似乎是转移性乳腺癌的一个重要特征之一。我们拟探究MTDH可否被miRNA靶向调控,前期我们借助信息生物学方法发现MTDH可能是miR-30a的靶基因。近来,miRNA-30a因其在多个生理病理过程(包括发育、分化、衰老、凋亡和自噬)中的重要作用而吸引了人们的研究兴趣,但是,miR-30a是否在乳腺癌进展中起到关键作用及其作用的具体分子机制尚未明了。因此,我们在本研究中拟对miR-30a在乳腺癌发生、进展过程中的作用进行研究。结果表明,在乳腺癌细胞系中过表达]miR-30a可以抑制乳腺癌细胞的生长和转移。同样,在裸鼠体内实验中,miR-30a可以抑制肿瘤的生长和远处肺转移。运用荧光素酶报告基因实验,我们证实了1niR-30a可以与MTDH基因的3’非翻译区结合从而抑制MTDH基因的功能。此外,干扰MTDH可以削弱miR-30a过表达带来的效应,过表达MTDH可以部分逆转miR-30a过表达的效应。值得注意的是,与正常乳腺组织相比,miR-30a在乳腺癌组织中呈低表达。进一步的临床研究表明miR-30a与乳腺癌淋巴结转移状态和乳腺癌肺转移均呈负相关。总而言之,我们的研究发现miR-30a可以通过靶向调控MTDH抑制乳腺癌的发生发展,表明IniR-30a在乳腺癌中扮演着抑癌基因的角色。我们的研究提示miR-30a可以作为乳腺癌预后的指标,同时也为乳腺癌的治疗提供了一条新的途径。第三部分Metadherin调节乳腺癌对TRAIL的敏感性摘要：MTDH基因是一把双刃剑,研究表明MTDH不仅在肿瘤转移中发挥重要的作用,其在肿瘤化疗耐药中也起着重要的作用。NCI60药物基因组学数据揭示了MTDH的过表达与肿瘤细胞的化疗耐受存在直接的关系,随后的体内外化疗耐受性分析表明干扰MTDH可以增强多种乳腺癌细胞对紫杉醇、阿霉素及顺铂的敏感性。肿瘤坏死因子(TNF)相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)是TNF超家族的一个成员,可以通过激活外源性凋亡通路诱导凋亡。近来,由于TRAIL显著的选择性诱导肿瘤细胞凋亡的特性(不杀伤正常细胞)而被认为是一种潜在的肿瘤治疗新药。目前正在进行和已完成的Ⅰ期和II期临床试验表明TRAIL是一种安全有效的药物。但是近期研究发现一些肿瘤细胞存在对TRAIL治疗的耐受,值得注意的是有相当一部分乳腺癌细胞对TRAIL诱导的凋亡具有耐受性。引起TRAIL耐受的机制目前尚未完全清楚,因而发现引起TRAIL耐受的原因将有助于人们制定基于TRAIL的更加有效的治疗策略。考虑到MTDH在化疗耐受中的作用,我们猜测MTDH可能是乳腺癌细胞克服TRAIL耐药性中的一个潜在靶点。在本研究中,我们运用一系列乳腺癌细胞和乳腺癌组织进行实验,发现MTDH的表达跟乳腺癌对TRAIL的敏感性相关。在裸鼠体内试验和体外细胞实验中我们发现,敲除MTDH可以增强乳腺癌MDA-MB-231细胞对TRAIL的敏感性；相反,在MCF-7细胞中过表达MTDH可以促进乳腺癌MCF-7细胞对TRAIL的耐受。在分子机制方面,MTDH可以下调caspase-8的表达,抑制caspase-8募集到死亡诱导信号复合物(DISC),抑制caspase-3口PARP的活化,促进Bcl-2的表达以及促进TRAIL诱导的Akt的磷酸化,而对于死亡受体表达无影响。此外,应用caspase抑制剂Z-VAD后可以抑制干扰MTDH的MDA-MB-231细胞对TRAIL的敏感性,表明干扰MTDH是通过激活caspase途径发挥作用的。干扰Bcl-2可以抑制过表达MTDH后MCF-7细胞对TRAIL的耐受,表明MTDH引起的Bcl-2的上调可以促进乳腺癌细胞对于TRAIL的耐受。我们进一步证实MTDH在一定程度上通过抑制miR-16而上调Bcl-2的表达。综上所述,体内外实验研究表明MTDH可以促进乳腺癌对TRAIL的耐受性。其机制是,MTDH通过miR-16介导的Bcl-2上调抑制细胞内凋亡途径并通过下调caspase-8抑制细胞外凋亡途径在TRAIL诱导的乳腺癌细胞凋亡中起到保护性作用。我们的研究结果提示,对TRAIL耐受的乳腺癌可以通过抑制MTDH增强其对TRAIL的敏感性,这可以作为克服乳腺癌TRAIL耐受的一个重要途径。