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无论是1型糖尿病(type 1 diabetes, T1DM)还是2型糖尿病(type 2 diabetes, T2DM),都以明显的胰岛β细胞缺失为特征。凋亡是β细胞缺失的主要形式,是胰岛素缺乏的直接原因,在糖尿病发生发展中发挥重要作用。在T1DM中,由巨噬细胞和T细胞分泌的炎性细胞因子,如IL-1β、TNFα和IFNγ等,是β细胞功能下降和损伤的主要诱导因素。而越来越多的证据表明,在T2DM中,炎性细胞因子也发挥着重要作用。这些证据提示阻断细胞因子介导的信号通路可能是抑制胰岛β细胞缺失的有效途径。Phosphatase and tensin homolog (PTEN),一个肿瘤抑制基因,在许多人类肿瘤中存在缺失或变异,是PI3K-Akt信号通路主要的负调控因子。PTEN功能的下调可以激活Akt生存信号途径,导致细胞过度增生及凋亡抑制,从而导致肿瘤的形成。但是,近来的研究表明PTEN的作用不仅仅限于肿瘤方面。在肝脏、肌肉、脂肪为主的胰岛素靶器官中,PTEN缺失可以影响葡萄糖的代谢,抑制小鼠中糖尿病的发生。更为重要的是,胰腺特异性敲除PTEN可以抑制链脲菌素(streptozotocin, STZ)诱导的糖尿病的发生,减少β细胞凋亡,但其具体机制尚不明确。细胞因子介导的细胞毒性是STZ发挥作用的主要机制之一,而且很多证据表明细胞因子通过诱导凋亡导致β细胞缺失。因此我们猜测PTEN可能在细胞因子诱导的β细胞凋亡中发挥一定作用。有报道证实,活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)及活性氮簇(reactive nitrogen species, RNS)的过度生成在细胞因子诱导的β细胞凋亡中发挥关键作用。由一氧化氮(nitric oxide, NO)和氧自由基反应生成的过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite, ONOO-),比二者具有更强的氧化活性。清除ONOO-可以减少非肥胖糖尿病(non obese diabetic, NOD)小鼠中细胞因子导致的β细胞损伤,降低其糖尿病的发病。在βTC3细胞中表达calbindin-D28k可以通过抑制ONOO-的形成抵抗细胞因子诱导的凋亡。这些结果提示ONOO-在细胞因子诱导的胰岛β细胞凋亡中发挥了关键作用。另外,研究表明氧化应激是PTEN表达/功能发生改变的重要调节因素。有研究指出在原代神经元细胞中,ONOO-可以抑制PTEN的作用,从而激活PI3K- Akt信号通路,抑制凋亡,发挥神经保护作用。而也有研究证实在人脐静脉内皮细胞中,高糖通过ONOO-介导PTEN上调,抑制Akt通路,从而促进细胞凋亡。可见,在不同条件下,ONOO-对PTEN表达的调控作用并不相同。因此,本实验将探讨PTEN在细胞因子诱导的胰岛β细胞凋亡中的作用以及ONOO-对PTEN的表达是否具有调控作用。实验内容如下:第一部分PTEN参与细胞因子诱导的β细胞凋亡目的:探讨PTEN是否参与细胞因子诱导的β细胞凋亡。方法:建立细胞因子诱导β细胞凋亡模型,采用Western Blotting方法初步确定细胞因子诱导的β细胞凋亡中是否涉及PTEN的改变,并对其下游信号Akt的变化进行观察。结果:经MTT比色试验、Hoechst染色及Caspase-3活性检测,三种细胞因子混合处理(IL-1β: 2 ng/ml; TNFα: 5 ng/ml; IFNγ: 25 ng/ml)可诱导明显的βTC-6细胞损伤,并且凋亡是其主要形式。Western Blotting结果显示,在细胞因子诱导的βTC-6细胞凋亡中,PTEN表达增加,其磷酸化增强,Akt磷酸化受到抑制。结论:PTEN参与了细胞因子诱导β细胞凋亡的过程。而且,PTEN通过磷酸化使其蛋白稳定性增加,可能是细胞因子处理后其表达上调的重要机制之一。第二部分PTEN敲减对细胞因子诱导β细胞凋亡的影响目的:探讨PTEN敲减对细胞因子诱导β细胞凋亡的影响。方法:采用RNA干涉方法敲减PTEN,通过MTT比色试验、Hoechst染色、Caspase-3活性检测观察细胞因子诱导的凋亡情况。采用Western Blotting方法观察PTEN敲减对Akt的影响。结果:瞬时转染PTEN siRNA后,PTEN和p-PTEN的基础表达明显降低,同时也抑制了细胞因子诱导的PTEN表达增加及其磷酸化增强。PTEN敲减可明显减少细胞因子诱导的β细胞凋亡,并且逆转细胞因子对Akt活化的抑制。结论:细胞因子诱导的β细胞凋亡及Akt抑制是PTEN依赖性的。第三部分ONOO-介导了细胞因子诱导的PTEN上调目的:探讨ONOO-在细胞因子诱导的PTEN上调中的作用。方法:ELISA法检测细胞因子诱导的ONOO-的形成;加入三种抗氧化剂(NAC:氧自由基的清除剂;L-NMMA:一氧化氮合成酶的抑制剂; UA:ONOO-的清除剂)对细胞进行预处理,观察ONOO-的形成、细胞凋亡情况及PTEN-Akt信号通路的改变;直接加入外源性ONOO-处理细胞,并对PTEN进行干涉,进一步确定ONOO-对细胞凋亡及PTEN-Akt信号通路的影响。同时采用非还原电泳观察PTEN的氧化修饰。结果:细胞因子处理可以促进ONOO-形成,加入三种抗氧化剂后,ONOO-形成减少,细胞凋亡受到抑制,PTEN-Akt通路得到部分恢复。直接加入外源性ONOO-可以诱导β细胞凋亡,且对PTEN-Akt信号通路的影响与细胞因子相似,而且干涉PTEN同样可以部分逆转ONOO-导致的细胞凋亡及信号通路的改变。但是,细胞因子处理不能使PTEN氧化。结论:在细胞因子诱导的β细胞凋亡中,ONOO-介导了PTEN的上调。但在此过程中,没有发生PTEN的氧化。