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目的艾滋病痴呆综合征(ADC)是HIV-1侵犯中枢神经系统(CNS)后引起的一种重要的神经系统并发症,其病变程度与大脑中HIV-1的数量并不总是相关,除病毒载量外ADC的发生还可能与HIV-1本身的基因突变及生物学活性的改变有关。HIV-1是自身高度变异的病毒,侵入CNS后,CNS特有的环境决定了HIV-1在CNS中的变异不同于外周。HIV-1的反式激活因子Tat可以诱导活化巨噬细胞和神经胶质细胞分泌各种细胞因子,引起神经元细胞的损伤,在ADC的发病机制中发挥重要作用。为了探讨HIV-1 tat基因在CNS和外周中的多样性以及这种多样性与ADC之间的关系,本论文对一例ADC病人和一例非ADC病人CNS和外周共9个部位来源的45株HIV-1 tat第一外显子基因序列进行了分析,并研究了tat基因变异导致的Tat氨基酸位点的改变对U87细胞分泌TNF-αIL-1β的影响,为探讨ADC的致病机制、预防和治疗ADC提供依据。方法1、以一例ADC病人和一例非ADC病人外周(淋巴结、脾脏)和CNS(脑膜、额叶灰质、颞叶、基底核、额叶白质)各部位基因组DNA为模板,巢式PCR扩增HIV-1 tat第一外显子及邻近基因序列,PCR产物连接到pGEM-T克隆载体后转化大肠杆菌DH5α,经氨苄青霉素及蓝白斑筛选出阳性菌落,每个部位选取5个HIV-1 tat克隆进行测序,使用BioEdit、MEGA4及HIV核酸序列库中的SNAP在线软件,对两例病人不同部位来源的HIV-1 tat序列分别进行系统发育树、基因距离、同义替换／非同义替换比值(ds/dn比值)及氨基酸位点分析。2、根据序列分析结果我们选取两例病人外周脾脏和中枢基底核部位来源的HIV-1 tat克隆各一株(共4株),PCR扩增出tat第一外显子基因,与pMD19-T克隆载体连接后转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素及蓝白斑筛选出阳性菌落,并用双酶切鉴定和测序证实。双酶切回收的tat第一外显子基因与经同样双酶切的逆转录病毒表达载体MSCV-IRES-GFP (MIG)连接,转化后,氨苄青霉素筛选出MIG-tat重组逆转录病毒表达载体,用双酶切鉴定证实。然后将MIG-tat重组逆转录病毒表达载体与pUMVC、pCMV-VSV-G共转染293T细胞,荧光显微镜下观察逆转录病毒包装情况。收获293T细胞上清液,经逐孔稀释法测定逆转录病毒感染滴度,然后以相同滴度病毒感染U87细胞,荧光显微镜检测重组逆转录病毒蛋白表达情况,ELISA法测定U87细胞上清中TNF-α、IL-1β的含量,SPSS软件对数据进行统计学处理。结果1、成功克隆了一例ADC病人和一例非ADC病人外周和CNS共9个部位来源的45株HIV-1 tat基因,经测序BLAST分析证实均为HIV-1 tat基因序列。系统进化树可见,ADC病人不同部位来源的tat基因大多位于各自的进化枝上少数存在交叉现象,说明ADC病人来源tat基因变异过程中受到明显区室化作用影响；非ADC病人不同部位来源的tat基因交叉在一起,说明非ADC病人来源tat基因变异过程中受区室化作用影响较小。2、基因距离分析结果表明,同为外周或同为CNS来源的tat序列间基因距离较小,而外周和CNS的tat序列间基因距离较大,并且同一例病人外周tat序列总比CNS tat序列变异大一些,由此可见,除病毒自身变异外,CNS和外周不同的机体环境对基因变异也具有一定的选择作用。另外,ADC病人外周和CNS tat序列与HXB2 tat标准序列间的基因距离差异有显著性(p<0.05),而非ADC病人外周脾脏和中枢基底核来源tat序列与HXB2 tat标准序列间的基因距离没有明显差异(p>0.05),可见,不同病人感染的病毒不同、病变严重程度不同及机体的免疫功能不同都会对HIV的基因变异产生影响。3、HIV在进化过程中受到自身变异和环境选择的双重作用,ds/dn值是估计分子进化机制的重要参数。ADC病人所有HIV-1 tat基因序列ds/dn=3.6653±2.5555,外周来源HIV-1 tat基因序列ds/dn=3.8976±0.0000,中枢神经系统来源HIV-1 tat基因序列ds/dn=1.9241±1.0838;非ADC病人所有HIV-1 tat基因序列ds/dn=4.5448±2.9407,外周来源HIV-1 tat基因序列ds/dn=3.2528±1.7273,中枢神经系统来源HIV-1 tat基因序列ds/dn=5.5216±3.5461,以上ds/dn值均大于1,表明两例病人外周和CNS来源的tat基因变异时均受到负向选择压力,病毒自身变异起主要作用,同时机体倾向于清除有害的非同义突变。4、氨基酸位点分析结果显示,ADC及非ADC病人来源Tat的氨基酸位点变异不同,同一病人外周和CNS的氨基酸变异位点及频率也不相同,有些氨基酸位点变异在CNS和外周都有发生,有些位点变异只发生在CNS,有些位点变异只发生在外周。5、根据序列分析结果,我们选取两例病人外周脾脏和中枢基底核来源的HIV-1 tat基因克隆各一株,命名为Sa、Ba、Sn、Bn (S代表脾脏、B代表基底核、a代表ADC病人、n代表非ADC病人),并成功构建了4个含有HIV-1 tat基因的重组逆转录病毒表达载体Sa/MIG、Ba/MIG、Sn/MIG、Bn/MIG,将上述重组逆转录病毒表达载体与pUMVC、pCMV-VSV-G共转染293T细胞,成功包装了重组逆转录病毒,逐孔稀释法测定重组逆转录病毒的感染滴度为5×106～6.33×106 IU/ml。6、相同感染滴度重组逆转录病毒感染U87细胞后,ELISA检测细胞上清中细胞因子含量,结果显示,逆转录病毒阴性对照组与U87细胞对照组TNF-α、IL-1β的含量没有显著性差异(p>0.05),说明逆转录病毒对TNF-α、IL-1β的分泌没有影响；Tat蛋白实验组U87细胞分泌TNF-α、IL-1β的含量均高于阴性对照组(p<0.05),说明Tat蛋白能诱导U87细胞分泌TNF-α, IL-1β;4个Tat蛋白实验组中,U87细胞分泌TNF-α的含量无明显差异(p>0.05),说明这4个Tat序列氨基酸位点的改变对U87分泌TNF-α的水平无影响；而Sa、Ba、Sn 3个Tat蛋白实验组U87细胞分泌IL-1β的含量均高于Bn Tat蛋白实验组(p<0.05),说明Tat氨基酸某些位点的改变能增强U87细胞分泌IL-1β的能力。结论1、ADC及非ADC病人来源的HIV-1 tat基因均存在多样性,ADC病人HIV-1tat基因的区室化效应明显高于非ADC病人,ADC病人外周和CNS来源的tat基因之间的差异比非ADC病人更大,同一病人HIV-1 tat基因变异在外周大于中枢神经系统。dn/ds值显示,两例病人体内HIV-1自身变异起主要作用,同时机体倾向于清除有害的非同义突变。ADC及非ADC病人tat基因变异引起的Tat氨基酸位点变异不同,同一病人外周和中枢神经系统Tat氨基酸变异位点及频率也不相同。2、HIV-1 Tat蛋白能诱导人神经胶质瘤细胞U87分泌细胞因子TNF-αIL-1β。并且ADC病人脾脏、基底核和非ADC病人脾脏来源的HIV-1 Tat蛋白诱导U87分泌IL-1p水平明显高于非ADC病人基底核来源的HIV-1 Tat蛋白,说明tat基因变异导致的Tat某些氨基酸位点的改变能增强U87细胞分泌细胞因子IL-1β的能力,这可能与ADC病人神经细胞损伤有关。