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目的大量研究表明烟草烟雾能引起机体各个系统的疾病,而机体的疾病状态往往与细胞线粒体的损伤有关。线粒体在介导细胞凋亡的过程中起着至关重要的作用,在细胞凋亡的过程中,线粒体的膜通透性的异常,能引起线粒体膜电位的降低,相关凋亡蛋白表达水平改变,细胞的氧化和抗氧化水平的失衡。研究线粒体在介导细胞凋亡过程中的具体机制,对于进一步研究细胞凋亡的调控机制具有重要意义。本文旨在探索烟草烟雾凝集物(cigarette smoke condensate,CSC)对永生化人支气管上皮细胞(immortalized human bronchial epithelial,BEAS-2B)的线粒体损伤机制,为进一步研究CSC的毒作用机制以及预防烟草烟雾引发机体疾病提供科学依据。方法1.用CSC对融合至70%左右的BEAS-2B细胞进行染毒,染毒持续24小时,染毒后的BEAS-2B细胞即为实验所用细胞。2.设立二甲基亚砜组(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)为溶剂对照组、正常未染毒BEAS-2B组(空白对照组)、CSC染毒组,通过细胞形态学观察、划痕实验、流式细胞仪、ELISA、CCK-8技术检测各组细胞形态变化、细胞凋亡率以及功能改变。3.运用ELISA、Western blot、RT-qPCR技术检测各组细胞的线粒体膜电位是否改变以及各组细胞凋亡相关基因、蛋白的相对表达。结果1.CSC染毒对BEAS-2B细胞形态及功能的影响CSC染毒后抑制了BEAS-2B细胞活性,且随CSC染毒终浓度的增加,BEAS-2B细胞存活率不断下降,呈现出剂量效应关系;与空白对照组BEAS-2B细胞相比,DMSO溶剂对照组细胞形态上没有明显变化;0.02mg/mLCSC染毒组细胞及胞核的形态均无明显改变,但少数细胞内出现空泡,0.04mg/mL组细胞出现肿胀变形,细胞核开始增大变形,核仁增大,出现核畸形;0.06mg/mL组开始胞膜形态开始变形,胞膜间出现了针刺样突起,胞内出现大量空泡;0.08mg/mL组细胞面积增大,细胞及胞核明显变形,一些细胞膜出现轮廓变形模糊,胞膜结构开始崩解,少量细胞出现核碎裂等特征;在6h、12h、24h、48h检测点时,溶剂对照组及各CSC浓度组细胞的迁移距离差异均有统计学意义(均P<0.05)。DMSO组与正常BEAS-2B细胞组迁移距离的差异均无统计学意义(均P>0.05)。2.染毒后各组细胞ROS的检测激光共聚焦显微镜下观察到随着CSC染毒浓度的提高,细胞内ROS荧光信号强度也随之增强。荧光酶标仪检测结果显示DMSO组与各CSC染毒组整体ROS水平具有差异,且差异有统计学意义(F=143.390,P﹤0.05);DMSO组与0组(空白对照)组间差异没有统计学意义(P>0.05);各不同浓度CSC染毒组细胞间ROS水平差异均有统计学意义(均P﹤0.05)。3.SOD活性检测以DMSO组为对照,各组细胞整体SOD活力水平差异具有统计学意义(F=195.680,P﹤0.05),除空白对照组外,各CSC染毒组细胞与DMSO组比较,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。随着CSC染毒浓度的提高,SOD活力单位逐渐降低。4.细胞凋亡率的检测以DMSO组为对照,使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示:DMSO溶剂对照组与空白对照组比较,凋亡率差异无统计学意义(均P>0.05)。不同浓度CSC处理后,细胞的凋亡率上升。CSC染毒组细胞凋亡率均大于DMSO组细胞(均P<0.05),且随着CSC染毒浓度的升高,细胞凋亡率逐渐升高。5.线粒体膜电位的检测激光共聚焦显微镜下观察到随着CSC染毒浓度的提高,细胞内红绿荧光比明显下降,提示CSC染毒BEAS-2B细胞引起其线粒体膜电位下降,且膜电位下降程度随CSC染毒浓度的升高而增强6.各组细胞Bcl-2、Bax、Cyt-C和caspase-3基因mRNA的检测荧光定量qPCR检测结果显示0组(空白对照组)细胞与DMSO组间mRNA的表达量相比,差异无统计学意义(P>0.05),而其余各CSC浓度染毒组Bcl-2、Bax、Cyt-C和caspase-3基因mRNA表达量与DMSO组表达量间差异均有统计学意义(P<0.05);Bcl-2基因:0.02组、0.04组、0.06组、0.08组的表达量均低于DMSO组,差异有统计学意义(P<0.05),且随CSC染毒浓度的提高,Bcl-2表达量逐渐降低;Bax、Cyt-C和caspase-3基因:各CSC组表达量均高于DMSO组,差异有统计学意义(P<0.05),随着CSC染毒浓度的提高,Bax、Cyt-C和caspase-3基因表达量逐渐升高7.Bcl-2、Bax和活化的caspase-3蛋白表达情况的检测Western Blot检测细胞蛋白结果显示:空白对照组与DMSO组的Bcl-2蛋白表达量相比,差异无统计学意义(P>0.05),而CSC染毒组的Bcl-2蛋白表达量低于DMSO组,差异均有统计学意义(P<0.05),空白对照组的Bax和活化的caspase-3蛋白的表达量与溶剂对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);CSC组Bax和活化的caspase-3蛋白表达量均高于DMSO组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论CSC诱导BEAS-2B细胞产生氧化损伤,导致细胞活力降低、细胞形态改变以及迁移能力改变,引起细胞内氧化与抗氧化水平的失衡,线粒体在氧化应激状态下膜通透性增强,导致Bax表达上调、Bcl-2表达下调,引起细胞色素C的释放和caspase-3激活,最终引起线粒体介导的凋亡途径的恶性循环。