[背景]麻风是一种由麻风分枝杆菌感染易感个体,侵犯皮肤和外周神经,晚期可致残的一种慢性传染病。麻风曾在全球范围内大规模流行,上世纪80年代由于联合化疗方案的推广,麻风的患病率在短时间内大幅度下降,然而由于缺乏有效的预防手段,新发病例下降并不明显,全球每年仍有逾20万新发病例,我国每年仍有600-800例新发病例。麻风仍旧是世界卫生组织和我国政府重点关注的一个疾病。流行病学研究发现暴露于麻风分枝杆菌的个体仅5%会被感染,感染者发病不足1%,且麻风分枝杆菌具有极强的保守性,提示宿主的遗传素质在疾病发生发展中发挥重要作用,遗传度达57%。课题组在国际上率先开展了麻风的全基因组关联性研究,迄今共发现32个麻风易感基因位点,并率先阐释了 NOD2基因介导的固有免疫缺陷在麻风发病中的核心作用,但NOD2基因致病变异如何导致麻风发病风险增加的分子机制有待阐释。NOD2受体是一种细胞内模式识别受体（PRRs）,其通过识别保守的病原体相关分子模式（PAMPs）实现对病原体的固有免疫应答,并激活NF-κB或MAPK通路进而启动核内转录。已有文献证实从麻风分枝杆菌中提取的结构特异的胞壁酰二肽（MDP）可被人单核细胞中的NOD2受体识别,从而诱导IL32的产生,以诱导单核细胞分化为CD1+DCs。然而,NOD2主要表达于巨噬细胞和树突状细胞（DC）等抗原递呈细胞和上皮细胞中,是否在巨噬细胞中发挥类似作用有待进一步证实。同时,目前尚不清楚NOD2识别灭活的麻风分枝杆菌后是经何种通路介导IL32的表达,以及NOD2的致病变异是否影响上述对麻风菌的免疫过程。[目的]1.证实巨噬细胞中存在麻风分枝杆菌MDP/NOD2/IL32信号通路;2.探究麻风分枝杆菌MDP激活NOD2受体后介导IL32产生的通路;3.在麻风病例中对NOD2基因进行深度测序,分析致病突变位点;4.探讨NOD2基因致病突变位点增加麻风发病风险的机制。[方法]1.qPCR检测巨噬细胞中NOD2受体的激活情况;通过转染siRNA质粒建立稳定低表达NOD2的细胞株,通过过表达野生型NOD2质粒和过表达突变型NOD2质粒,建立稳定高表达野生型及突变型NOD2的细胞株;qPCR及Western bolt检测野生型巨噬细胞和低表达NOD2细胞中,灭活的麻风分枝杆菌刺激IL32表达的能力。2.灭活的麻风分枝杆菌刺激巨噬细胞后,分离提取细胞核蛋白,并Western bolt检测NF-κB通路的激活情况。抑制NF-κB通路后,qPCR检测IL32的表达情况。3.利用MIPgen软件设计NOD2基因的分子倒置探针并对1000例麻风患者和1000例健康对照的NOD2基因编码区域进行捕获富集和测序;利用GATK软件和Plink软件分析出差异表达的突变位点;通过SIFT和POLYPHEN对突变位点的有害性进行预测及筛选出致病突变。4.qPCR检测过表达野生型和突变型NOD2细胞中,IL32的表达量并计算Fold Change 值。[结果]1.巨噬细胞中存在麻风分枝杆菌MDP/NOD2/IL32的信号通路。qPCR检测灭活的麻风分枝杆菌刺激后巨噬细胞中NOD2的表达量显著升高,MDP可以激活NOD2受体。qPCR检测转染siRNA后NOD2的表达量显著降低。qPCR和Western bolt检测灭活的麻风分枝杆菌刺激巨噬细胞后,IL32的表达量显著升高,而低表达NOD2则抑制该NOD2/IL32反应。2.灭活的麻风分枝杆菌激活NOD2受体后,通过NF-κB通路介导IL32的产生。Western bolt检测灭活的麻风分枝杆菌刺激后细胞核内蛋白P-p65的含量显著升高,表明麻风分枝杆菌MDP激活NF-κB通路。抑制NF-κB通路后,qPCR检测IL32的表达量明显下降,表明IL32的产生依赖NF-κB通路。3.NOD2基因深度测序中发现4个与麻风相关的突变位点,其中三个为致病突变,一个为同义突变。选择位于CARD1结构域的rs780204985致病突变进行功能研究。4.突变型NOD2导致NOD2/IL32通路反应性降低。qPCR检测过表达野生型和突变型NOD2细胞受灭活的麻风分枝杆菌刺激后,IL32的表达量。结果显示过表达野生型NOD2受麻风杆菌MDP刺激后,IL32的表达量显著升高,而突变型NOD2则通过降低NOD2/IL32的反应性,抑制IL32的表达量。[结论]本研究在细胞功能层面证实了NOD2基因与麻风发病的相关性,初步揭示了NOD2致病变异降低NOD2/IL32通路反应性增加麻风发病风险的分子机制,为麻风的精准预防与治疗提供了理论依据。