番泻叶安全性评价与红曲发酵番泻叶降解蒽醌工艺的研究

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番泻叶作为一种全球范围内广泛使用的中草药,主要应用于泻下通便,而蒽醌及其衍生物是泻下基质发挥作用的主要活性物质。蒽醌在该属植物中广泛存在,但是由于其潜在的肝肾肠等毒性,一直是限制番泻叶使用的最主要因素。因此为了系统对番泻叶安全性进行评价以及发酵改善其药性,本研究首先建立了番泻叶中蒽醌类化合物的检测分析方法,采用离子液体-分散液-液微萃取联合高效液相色谱分析番泻叶提取液中的蒽醌类化合物。同时对番泻叶提取液进行了急性亚急性小鼠毒性实验,确定了番泻叶提取液的最大安全剂量等,对番泻叶提取液及蒽醌单体进行了人体肝肾细胞毒性实验,用以评估番泻叶的安全性;最后利用实验红曲菌株对番泻叶进行液态发酵用以降解番泻叶中的蒽醌类化合物,以期达到扩大番泻叶的应用范围的目的。主要的研究结果如下:(1)首先建立了一种番泻叶中蒽醌类化合物的方便快速的前处理和检测方法,即离子液体-分散液-液微萃取联合高效液相色谱分析测定番泻叶种的蒽醌类化合物。先通过比较不同类型的离子液体对蒽醌类化合物的萃取效果,确定了最适萃取剂,其次对萃取剂比例和分散体类型和比例以及p H等相关条件进行了优化分析。通过优化分析确定了最佳提取条件为:使用50μL[Be Mim][Tf2N]离子液体作为萃取剂,分散剂为700L甲醇,在p H为4的条件下超声萃取6 min。在该条件下对4种蒽醌单体的LOD和LOQ分别为4.1-8.2g·L-1和1.6-3.4g·L-1,具有良好的线性关系(R~2=0.999)。该方法在分析不同地区(中国云南、印度、印度尼西亚)的番泻叶中的蒽醌类化合物时,回收率在92.1-99.8%之间,具有较好的应用价值。总体来说,本部分基于离子液体的简单分散液-液微萃取技术,并结合HPLC-UV检测,实现了番泻叶中的蒽醌类化合物的定量分析。(2)其次通过对番泻叶提取液进行急性及亚急性毒性试验了解其毒作用的性质和靶器官等,还对番泻叶提取液和蒽醌单体进行了人体正常肝、肾细胞毒性实验,初步评价番泻叶的安全性。结果显示番泻叶提取液无明显急性毒性和亚急性毒性,但是部分实验组动物肝、肾、结肠、胃出现一定程度的损伤;细胞毒性实验中,对于四种蒽醌单体,大黄素和大黄酸能明显的抑制体外培养的L-02细胞和HK-2细胞的生长,大黄素对HK-2细胞和L-02细胞的IC50在125-150mol·L-1和150-200mol·L-1之间,大黄酸对HK-2细胞和L-02细胞的IC50在150-175mol·L-1和50-100mol·L-1之间,大黄素对L-02细胞细胞膜的损伤最严重,大黄酚次之;而对三批次的番泻叶提取液,对L-02细胞和HK-2基本无明显毒性,对L-02细胞膜有一定的损伤作用,在低剂量(100g·m L-1)时对L-02细胞体外培养LDH漏出率最高可达到123%。(3)最后通过筛选高产色素低产桔霉素红曲菌株对番泻叶进行了降解蒽醌的发酵实验,确定了最佳的发酵条件。首先对实验室的24株红曲菌株进行性能测定,以红曲色素作为功能指标,筛选出高产色素并且低产桔霉素的红曲菌株H1102作为发酵番泻叶的初始发酵菌株,以蒽醌降解率作为主要评价指标,同时关注红曲色价和桔霉素的相关含量,对碳氮源及其浓度以及p H进行了条件优化,确定了最佳的发酵培养基配比。最后对发酵工艺的相关参数,包括接种量、装料量和料液比三种发酵条件进行了单因素优化后进行了响应面分析,确定最佳降解蒽醌条件为:500 m L三角瓶的装料量为85 m L,接种红曲种子液8.4%,料液比12.3%,在此条件下蒽醌降解率达到了41.2%,红曲色价达到了212.2 U·m L-1,桔霉素含量仅为0.038 mg·L-1,达到了红曲发酵番泻叶降解蒽醌的要求。
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