论文部分内容阅读
牛结核病是由分枝杆菌属的牛分枝杆菌引起的一种人畜共患的慢性消耗性传染病。目前,对于结核病的防治主要以预防为主,而卡介苗是用于预防结核病的唯一疫苗,但其免疫效果并不稳定。因此,开发研究新型高效的结核病疫苗依然是当下牛结核病防治的首要任务。病毒载体是构建重组疫苗相对理想的候选载体,其中复制缺陷型腺病毒载体在结核病疫苗研究中使用广泛。近几年来,由于单个蛋白基因制成的疫苗,其抗原性往往不甚理想,因此,将多个具有保护效果的抗原基因融合,制成活载体病毒疫苗成为了很多学者研究的热点。本实验研究以复制缺陷型人5型腺病毒为表达载体,构建表达牛分枝杆菌mpb83和ag85b融合基因的重组腺病毒,并在小鼠模型中进行免疫研究分析。本研究方法是以质粒pMD-83-85bL作为模板,PCR扩增目的基因mpb83-ag85b并构建腺病毒穿梭质粒pacAd5CMV-83-85b。通过PacⅠ限制性内切酶作用下对其与腺病毒骨架质粒pacAd5 9.2-100分别线性化,在转染试剂LipoFiter?的作用下共转染入HEK293细胞内进行重组腺病毒的包装。获得重组腺病毒命名为rAd5-CMV-83-85b并对目的基因进行PCR鉴定。大量扩增并进行纯化,同时测定其病毒滴度。间接免疫荧光试验(IFA),反转录PCR试验(RT-PCR)和Western blotting进一步检测目的基因mpb83-ag85b在转录水平和蛋白水平的表达。对小鼠进行免疫,加强免疫一次,利用流式细胞仪对各组免疫小鼠脾内的T淋巴细胞亚群和分泌IL-2,IFN-γ等细胞因子的淋巴细胞进行检测,同时利用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)对免疫小鼠血清中IgG进行检测。本研究实验结果:1、成功构建重组腺病毒穿梭载体pacAd5CMV-83-85b和获得重组腺病毒rAd5-CMV-83-85b;2、通过IFA和RT-PCR检测MPB83-Ag85B融合蛋白在体外能够表达并具有生物学活性;3、血清学水平检测到rAd5-CMV-83-85b组免疫小鼠的IgG水平高于其他三组且差异显著(P<0.05)。淋巴细胞检测显示rAd5-CMV-83-85b组小鼠体内的CD4~+T淋巴细胞数高于0.9%NaCl组、rAd-CMV-NpA组差异显著(P<0.05),低于BCG组差异不显著(P>0.05)。CD8~+T淋巴细胞检测分析结果rAd5-CMV-83-85b高于0.9%NaCl组和rAd-CMV-NpA组差异显著(P<0.05),高于BCG组差异不显著(P>0.05)。流式细胞仪检测细胞因子结果分析显示rAd5-CMV-83-85b组分泌IFN-γ的淋巴细胞数高于空载腺病毒组和0.9%NaCl组且均差异显著(P<0.05),比BCG组低但差异不显著(P>0.05)。分泌IL-2的淋巴细胞数高于空载腺病毒组和0.9%NaCl组且差异显著(P<0.05),略低于BCG组差异不显著(P>0.05)。通过血清学水平检测和流式检测结果分析表明重组腺病毒rAd5-CMV-83-85b能够诱导小鼠产生体液免疫及细胞免疫应答反应,具有较好的免疫原性。通过对重组腺病毒疫苗rAd5-CMV-83-85b的研究,为进一步研究其作为牛结核病疫苗奠定了基础。