研究背景和目的目前,中国已成为世界第一糖尿病大国,2008年中华医学会糖尿病学分会(CDS)组织的糖尿病流行病学调查结果显示,在20岁以上的人群中,年龄标化的糖尿病患病率为9.7%,而糖尿病前期的比例高达15.5%。糖尿病前期是糖尿病高危人群,约60%糖尿病患者来自此人群。2型糖尿病的病理生理机制呈复杂及多方面性,2008年Banting奖获得者Defrozon教授总结近年研究进展,提出胰岛β细胞分泌缺陷、肌肉组织葡萄糖摄取减少、肝糖输出增加、脂毒性、肠促胰岛激素减少、α细胞分泌胰高血糖素增多、肾小管重吸收葡萄糖增加及中枢对葡萄糖摄取的抑制反应下降8种2型糖尿病发病相关的病理生理机制。这些因素导致机体对葡萄糖摄取及储存、处理能力下降。而早在糖耐量减低阶段,胰岛p细胞数量已有明显下降,在确诊2型糖尿病时,胰岛p细胞数量下降可达60%,功能丧失可达80%。因此针对胰岛p细胞增殖、凋亡及分泌功能的研究至关重要。大量研究业已证实,神经末梢释放的乙酰胆碱可激活胰岛β细胞膜3型毒蕈碱样胆碱能受体(type3muscarinic acetylcholine receptors, M3R),进而作用于磷酸肌醇—蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)途径引起胰岛素分泌的扩增。而应用佛泊酯(Phorbol12-myristate13-acetate, PMA)直接兴奋PKC后,反而引起p细胞钙离子外流,抑制胰岛素释放,抑制乙酰胆碱扩增胰岛素释放作用。在中枢海马组织,海马胆碱能神经刺激肽前体蛋白(Hippocampal Cholinergic Neurostimulating Peptide precursor protein, HCNP-pp)经类糜蛋白酶裂解为HCNP。HCNP是含有11个氨基酸残基的多肽,可通过激活胆碱乙酰基转移酶(Choline acetyltransferase, ChAT)促进乙酰胆碱合成,进而活化胆碱能神经受体系统。然而,HCNP对胰岛β细胞是否具有提高ChAT活性、活化M3R,进而促胰岛素分泌,目前尚无文献报道。HCNP-pp广泛存在于组织细胞中,又称为磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyl-ethanolamine-binding protein, PEBP)及raf-1激酶抑制蛋白(Raf-1kinase inhibitor protein, RKIP)。它可抑制raf-1激酶磷酸化,进一步抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号转导途径的活化,抑制细胞增殖。已有研究证实,MAPK在胰岛β细胞增殖、分化中起重要作用,HCNP-pp特异地存在胰岛p细胞,作为Raf-1特异性抑制剂,可抑制p细胞增殖。然而,糖尿病状态下胰岛HCNP-pp含量如何变化,是否与β细胞增殖能力下降相关,目前尚无文献报道。胰高血糖素样多肽-1(Glucagon-like peptide-1, GLP-1)在“肠—胰岛轴”中起重要作用。它作用于p细胞上G蛋白偶联的特异性受体,不但通过环磷酸腺苷-蛋白激酶A途径起“肠促胰岛素”作用,还与乙酰胆碱协同作用活化胆碱能神经受体引起胰岛素分泌。此外,细胞培养及动物实验业已证实GLP-1可激活MAPK通路,促进β细胞增殖。利拉鲁肽作为人胰高血糖素样多肽-1类似物,在促进胰岛素分泌及促进β细胞增殖均有明显作用,可能成为治疗糖尿病前期理想药物。然而利拉鲁肽是否可阻抑糖尿病前期的进展,利拉鲁肽的上述作用是否与HCNP及其前体蛋白相关,目前尚无文献报道。综上所述,本课题以p细胞株INS-1细胞及糖尿病前期OLETF大鼠为研究对象,从以下两个方面进行相关研究：1,观察HCNP对INS-1细胞胰岛素分泌的影响；通过对ChAT、M3R基因水平检测,探讨HCNP对INS-1细胞作用的相关途径。2,观测利拉鲁肽干预的糖尿病前期OLETF大鼠胰岛β细胞增殖及胰岛素分泌的变化；进一步对不同状态的OLETF大鼠胰岛细胞HCNP-pp、HCNP及GLP-1R的蛋白、基因水平进行检测,同时检测ChAT及M3R基因表达,探究利拉鲁肽影响胰岛增殖、胰岛素释放的可能机制。第一部分HCNP对INS-1细胞胰岛素分泌的影响目的：探讨HCNP对INS-1细胞胰岛素分泌的影响及可能的作用途径方法：(1) HCNP合成及纯度检测：应用固相化学合成技术人工合成含11个氨基酸残基的多肽,序列为：H-Ala-Ala-Asp-Ile-Ser-Gln-Trp-Ala-Gly-Pro-Leu-OH采用反向高效液相色谱及电喷雾质谱法对产物进行分离纯化。(2) INS-1细胞的培养及活性鉴定：以含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基及在37℃,5%CO2培养箱中培养细胞。倒置相差显微镜观察生长情况。(3)胰岛素释放实验：80%INS-1细胞融合成片时,应用0.1%胰酶及0.1%EDTA混合液消化、吹散。接种于6孔板中,每孔6×105个细胞。随机分为3组：对照组、HCNP组、HCNP+PMA组。对照组INS-1细胞给予RPMI1640液培养,HCNP组INS-1细胞给予人工合成HCNP50pg/ml与RPMI-1640液共培养,HCNP+PMA组INS-1细胞予人工合成HCNP50pg/ml与RPMI-1640液共培养并在行胰岛素释放实验前加10nM PMA培养18小时。将各组INS-1细胞置于5%CO2培养箱中培养5天后弃上清,含3.3mmol/L葡萄糖KRBH液预培养40min,提取上清液,测定胰岛素浓度。3.0mlKRBH液再次冲洗后依次加含5.6、6.7mmol/L葡萄糖及新斯的明20μmol/L、氯化胆碱100μmol/L的KRBH液培养40min收集上清液,放射免疫分析方法测定胰岛素含量。(4) qRT-PCR检测ChAT及M3R基因表达水平：80%INS-1细胞融合成片时,应用0.1%胰酶及0.1%EDTA混合液消化、吹散。接种于6孔板中,每孔6×105个细胞。随机分为对照组及HCNP(?)；INS-1细胞经Trizol液裂解,按说明书提取总RNA,-80℃保存。设计ChAT、M3R基因mRNA序列的特异性引物,应用实时荧光定量PCR方法检测ChAT及M3R基因表达水平。结果：(1)在葡萄糖浓度为3.3mmol/L、5.6mmol/L及16.7mmol/L细胞培养上清液胰岛素含量。3.3mmol/L时,对照组、HCNP组及HCNP+PMA组分别为8.36±0.97、8.27±0.79、7.94±0.97μIU/ml;5.6mmol/L时,对照组、HCNP组及HCNP+PMA组分别为8.48±0.92、10.09±1.41、8.36±1.05μIU/ml;16.7mmol/L时,对照组、HCNP组及HCNP+PMA分别为8.73±0.75、10.82±1.32、8.88±1.01μIU/ml。当葡萄糖浓度为3.3mmol/L时,HCNP组胰岛素含量较对照组及HCNP+PMA组无显著变化,差异无统计学意义(F=0.535,P=0.592)；葡萄糖浓度达5.6mmol/L时,HCNP组胰岛素含量较对照组及HCNP+PMA组均增高,差异具有统计学意义(F=6.340,P=0.006)；同样,给予16.7mmol/L葡萄糖刺激INS-1细胞时,HCNP组胰岛素含量较对照组及HCNP+PMA组均增高,差异具有统计学意义(F＝10.836,P<0.001)。(2) HCNP处理组ChAT(3.01±0.47×105拷贝)及M3R(1.06±0.18)两者mRNA含量显著升高,对照组两者含量分别为：1.01±0.30、0.72±0.15；两组相比,ChAT、M3R基因表达水平的差异均具有统计学意义,ChAT(t=-8.837,), M3R(t=-3.546, P=0.005)。结论：(1)在3.3mmol/L葡萄糖浓度时,HCNP对INS-1细胞的胰岛素释放无明显作用,而在5.6mmol/L及16.7mmol/L葡萄糖浓度下,HCNP可促进INS-1细胞胰岛素释放,佛波酯可抑制HCNP此作用,提示HCNP作用可能通过PKC途径促进胰岛素释放。(2) HCNP组ChAT、M3R基因表达水平均高于对照组,提示HCNP促进胰岛素释放作用与INS-1细胞增高的ChAT、M3R基因表达相关。第二部分利拉鲁肽干预的糖尿病前期OLETF大鼠胰岛细胞HCNP-pp、HCNP变化对胰岛β细胞功能、增殖的影响目的：观测不同剂量利拉鲁肽干预的糖尿病前期OLETF大鼠HCNP-pp及HCNP变化对口服葡萄糖耐量试验、早期胰岛素分泌指数及胰岛素阳性细胞密度的影响,探究GLP-1R与HCNP-pp、HCNP的相关性。方法：(1) OGTT试验、早期胰岛素分泌指数及胰岛素阳性细胞表达密度检测：雄性4周龄OLETF大鼠饲养8-10周后,禁食15小时,行口服葡萄糖耐量试验(葡萄糖2g/kg,胃管灌入)葡萄糖氧化酶法分别检测30、60、90、120分钟鼠尾静脉血糖,按国际惯用的大鼠糖尿病诊断参考标准：血糖峰值>16.7mmol/L和糖负荷2小时血糖>11.1mmol/L,符合其中之一为糖耐量减低(Impaired Glucose tolerance, IGT)。将处于IGT阶段的OLETF大鼠随机分为3组,每组8只；分别给予100μg/kg(L-100组)、200μg/kg(L-200组)利拉鲁肽及生理盐水1.0mL/kg (PBO组),一日两次腹腔内注射。LETO组大鼠给予生理盐水1.0mL/kg腹腔内注射。在给药12周再次行OGTT试验,应用酶联免疫吸附方法检测早期胰岛素分泌指数(糖负荷后30min胰岛素增量与葡萄糖增量的比值)即ΔIns30/ΔGlu30=(Ins30-FINS)/(Glu30-FPG);取胰腺行免疫组织化学染色检测胰岛素阳性细胞表达密度(Insulin-positive cells density, Ins-PCD)。(2)胰岛细胞HCNP-pp、ChAT、M3R及GLP-1R mRNA荧光定量分析：将胰岛细胞应用Trizol液裂解,按说明书提取总RNA,-80℃保存。qRT-PCR法测定胰岛HCNP-pp mRNA、ChAT mRNA、M3R mRNA及GLP-1R mRNA表达水平(单位均以×105拷贝表示,下同)。(3)胰岛细胞HCNP-pp、GLP-1R蛋白表达分析：提取胰岛细胞总蛋白,用Bradford法测定蛋白含量。以每毫升样品中的毫克蛋白量(mg/ml)表示。P-actin作为HCNP-pp的内参照,采用Western印迹方法,增强化学发光法显示蛋白条带,测定大鼠胰岛CT-HCNP-pp、NT-HCNP-pp及GLP-1R蛋白的相对含量。结果：(1) OGTT试验、Δ Ins30/Δ Glu30及Ins-PCD:经12周利拉鲁肽干预,PBO组大鼠空腹血糖(8.39±1.14mmol/L)、糖负荷2小时血糖(11.45±1.23mmol/L)均显著高于L-100组(7.15±0.84,8.60±1.23)、L-200组(6.45±0.61,7.59±0.47)及LETO组(7.15±0.84,8.60±1.23)差异具有统计学意义；大鼠空腹血糖(F=22.925,P<0.001),,糖负荷2小时血糖(F=40.805,P<0.001)。而Δ Ins30/Δ Glu30(3.85±0.19)较L-100组(8.90±±0.37)、L-200组(9.55±0.25)及LETO组(11.99±0.31)明显降低,差异具有统计学意义(F＝8.895,P<0.001)；同PBO组胰岛素阳性细胞表达密度(0.67-±0.08,个/μm2)相比,L-100组(0.68±0.07)胰岛素阳性细胞表达密度无明显变化,差异无统计学意义,而L-200组(0.84±0.08,)、LETO组(0.90±0.08)胰岛素阳性细胞表达密度显著增多,差异具有统计学意义(F=15.968,P<0.001)。(2)大鼠胰岛细胞HCNP-pp、GLP-1R、ChAT及M3R基因表达情况：与PBO组HCNP-pp mRNA (5.38±1.47)相比较,LETO组(3.07±0.80)、L-100组(3.58±0.79)及L-200组(3.32±0.65)相对表达水平下降：与PBO组ChAT mRNA (0.85±0.21)、M3R mRNA (0.21±0.05)及GLP-1R mRNA(10.97±2.90)相比,LETO组(分别为：3.33±0.53,0.51±0.08,17.27±3.18)、L-100组(分别为：1.73±0.21,0.38±0.05,15.02±3.36)及L-200组(分别为：1.78±0.46,0.44±0.09,17.43±4.24)三者相对表达水平均明显增高,差异具有统计学意义；HCNP-pp mRNA(F=8.563, P<0.001), ChAT mRNA(F=55.106, P<0.001), M3R mRNA(F=27.201, P<0.001), GLP-1R mRNA(F=6.012,P=0.003)。(3)大鼠胰岛细胞HCNP-pp、GLP-1R蛋白表达情况：与PBO组CT-HCNP-pp (0.78±0.04)、NT-HCNP-pp(0.75±0.04)蛋白相对含量及NT-HCNP-pp/CT-HCNP-pp比值(0.96±0.02)相比较,L-200组(分别为：0.66±0.04,0.53±0.02,0.85±0.04)及LETO组(分别为：0.68±0.05,0.57±0.06,0.84±0.07)均明显减低,L-100组(分别为0.73±0.02,0.69±0.01,0.95±0.02)NT-HCNP-pp/CT-HCNP-pp比值与对照组差异无统计学意义。与PBO组GLP-1R蛋白相对含量(0.64±0.04)相比,L-100组(0.76±0.03)、L-200组(0.80±0.03)及LETO组(0.81±0.07)均明显增高,差异有统计学意义,CT-HCNP-pp (F=12.973, P<0.001), NT-HCNP-pp (F=18.250, P<0.001), NT-HCNP-pp/CT-HCNP-pp比值(F=17.632, P<0.001), GLP-1R(F=20.467, P<0.001)。(4)大鼠胰岛细胞HCNP-pp与GLP-1R蛋白、基因表达相关性分析：不同组别大鼠胰岛细胞CT-HCNP-pp (0.711±0.061)、NT-HCNP-pp(0.640±0.094)及NT-HCNP-pp/CT-HCNP-pp(0.897±0.071)与GLP-1R(0.750±0.083)蛋白相对水平呈负相关；同样,HCNP-pp mRNA(3.872±1.353)与GLP-1R mRNA(15.106±4.252)表达水平呈负相关。CT-HCNP-pp: y=-0.886X+1.380(R=0.649, t=-4.429, P<0.001); NT-HCNP-pp: y=-0.623X+1.148(R=0.701,t=-5.107, P<0.001); NT-HCNP-pp/CT-HCNP-ppy=-0.685X+1.364(R=0.582,t=-3.717, P=0.001); HCNP-pp mRNA:y=-1.563X+2.11(R=0.498,t=-2.982,P=0.006)。结论：(1)利拉鲁肽具有改善IGT阶段OLETF大鼠血糖、早期胰岛素分泌指数及胰岛β细胞数量,可阻抑糖尿病前期的进展。(2)安慰剂组OLETF大鼠12周后87.5%进展为2型糖尿病状态；胰岛细胞GLP-1R下降、HCNP-pp增多,HCNP减少。提示上述指标变化与2型糖尿病的发生、发展相关。(3)各组大鼠胰岛细胞HCNP-pp与GLP-1R表达水平均呈负相关,推测利拉鲁肽活化GLP-1R阻抑糖尿病前期进展与HCNP-pp表达下降相关。