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目的:白细胞介素6(IL-6)是一类重要的促肿瘤细胞因子,其通过自分泌在肾细胞癌(RCC)的发生和发展中起重要作用。肝细胞粘附分子(hepa CAM)属于抑癌蛋白,其在RCC发生早期因受各种因素影响出现下调或完全缺失。本项目研究中,将探讨IL-6与hepa CAM在RCC发生发展中的相互关系及作用机制。方法:1)收集74例RCC肿瘤组织和43例癌旁组织,免疫组化检测其IL-6和hepa CAM的蛋白表达水平。统计分析IL-6和hepa CAM在RCC肿瘤组织和癌旁组织中的表达差异,分析RCC肿瘤组织中IL-6和hepa CAM表达相关性,分析RCC肿瘤组织中IL-6、hepa CAM两者与临床病理参数之间的相关性。2)收集30位RCC患者的肿瘤组织、癌旁组织和血清标本,收集13位健康志愿者的血清标本,ELISA检测患者和健康志愿者的血清中IL-6的水平,Q-PCR和Western blot检测肿瘤组织和癌旁组织中hepa CAM的m RNA水平和蛋白水平。统计分析RCC患者和健康志愿者的血清IL-6水平差异,分析30例配对RCC肿瘤组织和癌旁组织hepa CAM的蛋白及m RNA表达差异,分析患者血清IL-6水平与RCC肿瘤组织中hepa CAM蛋白及m RNA表达之间的相关性。3)培养人RCC细胞株786-O、769-P、A498、ACHN和Caki-1,培养人永生化肾小管上皮细胞株HK-2。a)ELISA检测五种RCC细胞株培养上清液IL-6的水平,Q-PCR及western blot检测RCC细胞株和HK-2的hepa CAM m RNA和蛋白水平。b)外源性IL-6不同浓度(0、10、20、40ng/ml)和不同作用时间(0、6、12、24、48小时)处理769-P和Caki-1后,Q-PCR及western blot检测其hepa CAM的m RNA和蛋白水平。c、si RNA-IL-6转染细胞后,q-PCR及western blot检测细胞hepa CAM的m RNA和蛋白水平。d)hepa CAM过表达腺病毒转染ACHN和769-P后,ELISA检测上清液IL-6的水平,western blot检测hepa CAM、IL-6R和gp130蛋白表达水平。4)培养人RCC细胞株769-P,A498和ACHN。设置空白对照组、空载腺病毒组、IL-6处理组(20ng/ml)、hepa CAM过表达组以及IL-6处理联合hepa CAM过表达组。CCK-8检测各组细胞活性;克隆形成实验检测增殖能力;流式细胞技术细胞周期分布情况;western blot检测增殖相关分子C-myc、PCNA和cyclin D1的蛋白表达情况。5)培养人RCC细胞株769-P,A498和ACHN。a)si RNA-IL-6转染细胞,western blot检测下游磷酸化STAT3、ERK和AKT水平。b)外源性IL-6(20ng/ml)与不同抑制剂联用(JAK/STAT3抑制剂stattic[10u M]、MEK/ERK抑制剂U0126[5u M]和PI3K/AKT抑制剂MK-2206[1u M]),Western blot分别检测磷酸化及总的STAT3、ERK和AKT表达,检测hepa CAM蛋白表达情况,Q-PCR检测hepa CAM m RNA表达情况。c)外源性IL-6(20ng/ml)与stattic(10u M)或/和hepa CAM过表达腺病毒联合处理,CCK-8检测各组细胞活性。d)si RNA-IL-6、外源性IL-6(20ng/ml)或stattic(10u M)单独处理或联合处理细胞,Western blot检测DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达情况。e)外源性IL-6(20ng/ml)分别于与DNA甲基化转移酶抑制剂5-Aza(10u M)、si RNA-DNMT1或si RNA-DNMT3联合处理细胞,Western blot检测DNMT1、DNMT3b和hepa CAM蛋白表达,Q-PCR和甲基化特异性PCR检测hepa CAM m RNA表达和启动子甲基化水平结果:1)IL-6的蛋白表达在肿瘤组织中明显高于癌旁组织(P<0.001),hepa CAM的蛋白表达在肿瘤组织中明显低于癌旁组织(P<0.001)。在RCC肿瘤组织中,IL-6的高表达与hepa CAM的低表达具有显著一致性(kappa=0.748,P<0.001)。RCC组织中IL-6的表达与患者肿瘤分期存在正相关性(P=0.019),hepa CAM与所分析的各项临床病理参数之间无显著相关性。2)RCC患者血清IL-6水平显著高于健康志愿者(P=0.019),且患者血清IL-6水平与患者肿瘤分期存在正相关性(P=0.035)。Hepa CAM的m RNA表达在肿瘤组织中明显低于癌旁组织(P<0.001),western blot所检测的hepa CAM蛋白表达在肿瘤组织中低于癌旁组织。患者血清IL-6水平与hepa CAM m RNA和蛋白表达均无显著相关性。(m RNA:R=-0.1985,P=0.2931;蛋白:R=-0.2050,P=0.2772)。3)RCC细胞株中786-O、ACHN和A498的hepa CAM蛋白表达缺失,Caki-1和769-P低表达,而正常人肾小管上皮细胞株HK-2的hepa CAM高表达。外源性IL-6处理后,769-P和Caki-1中hepa CAM m RNA水平呈浓度和时间依耐性下调,769-P蛋白水平呈浓度和时间依耐性下调。沉默细胞IL-6表达后,769-P、A498、ACHN和Caki-1中hepa CAM m RNA和蛋白水平均上调。腺病毒转染使hepa CAM在细胞过表达后,769-P、ACHN的IL-6R和gp130蛋白表达未改变,细胞上清IL-6水平未改变。4)RCC细胞株ACHN、769-P和A498中,hepa CAM过表达能显著下调三株细胞的细胞活性、增殖能力,阻滞细胞于G1期,并下调C-myc、PCNA和cyclin D1的蛋白水平。外源性IL-6与之相反能上调三株细胞的细胞活性和增殖能力,使S期细胞增多,上调C-myc、PCNA和cyclin D1的蛋白水平上调。Hepa CAM转染与IL-6联合处理时,与对照组相比三株细胞活性、增殖能力均下调,细胞阻滞于G1期,增殖相关蛋白水平下调。提示hepa CAM能显著对抗IL-6促RCC细胞增殖的效应。5)沉默RCC的IL-6表达后,ACHN、769-P和A498中磷酸化的STAT3、ERK和AKT水平均下降(A498的ERK磷酸化水平除外),加入外源性IL-6后,三种细胞中磷酸化的STAT3、ERK和AKT水平均上调。三条通路不同抑制剂处理后,仅JAK/STAT3抑制剂stattic能使hepa CAM的m RNA水平和蛋白水平明显上调,并能显著抵消IL-6对hepa CAM表达的抑制效应。提示IL-6通过STAT3通路调节hepa CAM。IL-6/STAT3通路对hepa CAM的调节是通过DNMTs进行的,但在不同RCC细胞中机制尚不完全一样:在ACHN和769-P中,IL-6通过DNMT1诱导hepa CAM启动子异常高甲基化从而引起hepa CAM表达抑制;在A498中,IL-6通过DNMT3b诱导hepa CAM启动子高甲基化和表达抑制,同时也通过上调DNMT1来抑制hepa CAM表达,但此效应不涉及DNMT1的DNA甲基化修饰活性。结论:在RCC中,IL-6能通过STAT3通路上调DNMT1和DNMT3b表达,从而引起hepa CAM启动子区域异常高甲基化状态和hepa CAM表达抑制,最终促进RCC增殖。